GSK-3β在大鼠腦缺血再灌注損傷時(shí)對Nrf2的調(diào)控作用研究.pdf

1、背景：
　　腦缺血后的再灌注損傷嚴(yán)重威脅著人類的生命健康。氧化應(yīng)激在腦缺血再灌注損傷的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要作用。機(jī)體內(nèi)源性抗氧化系統(tǒng)能夠抵御氧化應(yīng)激損傷。Nrf2作為內(nèi)源性抗氧化系統(tǒng)中的關(guān)鍵因子，在腦缺血再灌注時(shí)，能夠有效對抗此過程中產(chǎn)生的氧化應(yīng)激損傷。因此，找到能夠有效調(diào)控Nrf2的關(guān)鍵分子，對于對抗腦缺血再灌注損傷至關(guān)重要。GSK-3β這個(gè)多功能激酶，在以往的很多研究中都表現(xiàn)出了對Nrf2的調(diào)控作用，它參與對Nrf2在細(xì)胞核內(nèi)

2、外的分布的調(diào)控，對其功能起負(fù)性調(diào)控作用。
　　目的：
　　探討GSK-3β在腦缺血再灌注損傷時(shí)對Nrf2的調(diào)控作用，通過調(diào)控內(nèi)源性抗氧化系統(tǒng)中的關(guān)鍵分子Nrf2，增強(qiáng)機(jī)體內(nèi)源性抗氧化作用，發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)功能。
　　方法：
　　（1）實(shí)驗(yàn)對象：SD大鼠（240-300g）
　?。?）篩選大鼠腦缺血再灌注損傷后GSK-3β活化時(shí)間點(diǎn)：構(gòu)建大鼠MCAO模型，栓塞1h后，再灌注1h、6h、24h這三個(gè)時(shí)間點(diǎn)后提取大腦

3、組織蛋白，運(yùn)用Western Blot法，評價(jià)以下四個(gè)蛋白的表達(dá)量的變化：GSK-3β、GSK-3β(P-tyr216)、β-catenin、Nrf2，選取GSK-3β活化的時(shí)間點(diǎn)作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)再灌注時(shí)間點(diǎn)。
　　（3）大鼠GSK-3βsiRNA/活性阻滯。
　?、伲篏SK-3β化學(xué)合成的siRNA片段左側(cè)側(cè)腦室注射SD大鼠，轉(zhuǎn)染48h后，檢測GSK-3βsiRNA在大腦皮層的轉(zhuǎn)染率，通過Western Blot法，評價(jià)以下蛋

4、白表達(dá)量的變化：GSK-3β、GSK-3β（P-tyr216）、Nrf2。熒光定量PCR法測定GSK-3βmRNA的表達(dá)量，以及Nrf2 mRNA的量，篩選最有效的干擾片段。
　?、冢捍笫髠?cè)腦室注射GSK-3β活性抑制劑（Licl、SB216763）。
　　（4）大鼠GSK-3βsiRNA/活性阻滯后，不構(gòu)建MCAO模型
　?、伲汉Y選出的GSK-3βsiRNA片段左側(cè)側(cè)腦室注射SD大鼠，55h后Western Blot

5、檢測GSK-3β、GSK-3β（P-tyr216）、總Nrf2、核內(nèi)Nrf2表達(dá)量的變化；熒光定量PCR檢測GSK-3β、Nrf2 mRNA量的變化。
　?、冢捍笫笞髠?cè)側(cè)腦室注射GSK-3β活性抑制劑（Licl、SB216763），通過Western Blot法檢測以下蛋白表達(dá)量的變化：GSK-3β、GSK-3β（P-tyr216）、總Nrf2、核內(nèi)Nrf2蛋白量；熒光定量PCR檢測GSK-3β、Nrf2 mRNA量的變化。

6、>　?。?）GSK-3βsiRNA/活性阻滯后，構(gòu)建大鼠MCAO模型。
　　①：篩選出的GSK-3βsiRNA片段左側(cè)側(cè)腦室注射SD大鼠，轉(zhuǎn)染48h后，構(gòu)建MCAO模型，運(yùn)用Western Blot法，檢測以下四個(gè)蛋白表達(dá)量的變化：GSK-3β、GSK-3β（P-tyr216）、總Nrf2、核內(nèi)Nrf2蛋白量；熒光定量PCR檢測GSK-3β、 Nrf2 mRNA量的變化；EMSA法檢測GSK-3β對Nrf2/ARE結(jié)合活性的影響；

7、qRT-PCR及Western Blot法分別檢測GSK-3β對 ARE編碼蛋白 NQO1、HO-1 mRNA及蛋白表達(dá)的影響。
　?、冢捍笫笞髠?cè)側(cè)腦室注射GSK-3β活性抑制劑（Licl、SB216763），抑制6h后，構(gòu)建MCAO模型，通過Western Blot法，檢測以下四個(gè)蛋白表達(dá)量的變化：GSK-3β、GSK-3β（P-tyr216）、總Nrf2、核內(nèi)Nrf2蛋白量；熒光定量PCR檢測GSK-3β、Nrf2 mRNA量

8、的變化；EMSA法檢測GSK-3β對 Nrf2/ARE結(jié)合活性的影響；qRT-PCR及Western Blot法分別檢測GSK-3β對 ARE編碼蛋白 NQO1、HO-1 mRNA及蛋白表達(dá)的影響。
　　結(jié)果：
　?。?）構(gòu)建大鼠MCAO模型，再灌注1h時(shí)， GSK-3β、GSK-3β（P-tyr216）表達(dá)量下降；再灌注6h、24h時(shí)，GSK-3β、GSK-3β（P-tyr216）表達(dá)量增加。再灌注1h時(shí)，β-cateni

9、n、Nrf2表達(dá)量增加，再灌注6h、24h時(shí)，β-catenin、Nrf2表達(dá)量減少。再灌注6h為GSK-3β再次被活化的時(shí)間點(diǎn)。
　?。?） GSK-3βsiRNA/活性阻滯后，不構(gòu)建MCAO模型，GSK-3β、GSK-3β（P-tyr216）蛋白表達(dá)量減少、GSK-3βmRNA量也減少；總Nrf2、細(xì)胞核內(nèi)Nrf2蛋白表達(dá)量及mRNA量均無明顯變化。
　?。?）GSK-3βsiRNA/活性阻滯后，構(gòu)建MCAO模型，再灌注