肝癌細胞對TRAIL固有耐藥和獲得性耐藥的分子機制研究.pdf

1、肝癌是世界上最常見并且致死率最高的腫瘤之一。目前針對肝癌的治療方法有手術切除、放療和化療等，但是這些治療方法療效有限，因此迫切需要開發(fā)新型的抗肝癌藥物。TRAIL(TNF-related apoptosis-inducing ligand，人腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體)對多種對傳統(tǒng)療法耐受的腫瘤展現(xiàn)出潛在抑制作用，并且副作用小。TRAIL與其特異性受體DR4和DR5結合后誘導受體寡聚化同時促進死亡誘導復合體的形成，進而激活起始半胱天冬

2、酶Caspase-8。在I類細胞中，凋亡受體激活Caspase-8后產(chǎn)生足夠強的信號刺激Caspase-3活化進而誘導細胞凋亡。相反，在II類細胞中，Caspase-8活化不足以直接激活Caspase-3?；罨腃aspase-8通過切割Bid蛋白進而誘導Bax蛋白活化，增加線粒體膜的通透性。促凋亡蛋白如cytochrome c、Smac和DIABLO等從線粒體內(nèi)釋放出來后進而激活Caspase-9和Caspase-3。一些針對TRAI

3、L及其受體的新型藥物已經(jīng)進入了臨床試驗，但是腫瘤細胞對TRAIL的耐藥性阻礙了這些藥劑成為真正的抗腫瘤藥物。盡管一些腫瘤細胞對TRAIL展現(xiàn)出敏感性，但是在TRAIL長期處理后顯示出耐藥性（獲得性耐藥）。因此，研究腫瘤細胞對TRAIL的先天和獲得性耐藥機制，發(fā)現(xiàn)對腫瘤細胞耐藥起關鍵作用的分子并對其進行干預，對提高TRAIL對腫瘤細胞的殺傷作用具有重要意義。
　　干擾素通過調(diào)節(jié)下游ISGs（IFN-stimulated genes，

4、干擾素刺激基因）表達來行使其生物學功能，研究表明干擾素通路紊亂會誘導ISGs過表達導致腫瘤發(fā)生和腫瘤耐藥。干擾素通過刺激細胞產(chǎn)生TRAIL或Fas等凋亡配體，進而激活下游外部或內(nèi)部線粒體依賴的凋亡通路而誘導細胞凋亡。在干擾素誘導線粒體依賴的細胞凋亡過程中，參與破壞線粒體膜通透性促進細胞色素釋放的多種蛋白被仍是未知的。干擾素調(diào)控的一些功能尚未完全明確的一些小分子蛋白包括ISG12a（The interferon alpha-inducib

5、le protein27，IFI27）、G1P3、IFITM3、IFITM2等。盡管ISG12a的表達調(diào)控已有一些研究，但是關于其生物學功能的研究還不多。目前一些研究結果表明ISG12a定位于線粒體上，對藥物誘導的細胞凋亡有調(diào)控作用，但是其在肝細胞中的表達情況報道較少，且目前尚無關于其調(diào)控TRAIL誘導細胞凋亡的相關報道。在本論文中，我們以ISG12a為研究對象，檢測其在肝臟組織及多種肝癌細胞系內(nèi)的表達情況，并探討其在TRAIL誘導肝癌

6、細胞凋亡過程中的作用。
　　為了研究肝癌細胞對TRAIL的固有耐藥機制，我們以TRAIL處理不同的肝癌細胞系后，利用western blot、流式細胞術、DNA瓊脂糖電泳等方式檢測細胞凋亡，結果顯示Huh7和HLCZ01細胞對TRAIL耐藥，LH86和HLCZ02細胞對TRAIL敏感。我們的研究結果表明TRAIL通過刺激cytochrome c的釋放并激活caspase-9誘導腫瘤細胞凋亡，流式分析結果表明caspase廣譜抑制劑

7、Z-VAD-FMK可抑制TRAIL誘導的肝癌細胞凋亡。通過實時定量PCR技術分析，我們發(fā)現(xiàn)干擾素刺激基因ISG12a在敏感細胞中表達高于耐藥細胞。在耐藥細胞中過表達ISG12a可增強TRAIL誘導的細胞凋亡，相反，在敏感細胞中沉默ISG12a則抑制TRAIL誘導的細胞凋亡。為了驗證ISG12a在體內(nèi)介導TRAIL誘導肝癌細胞凋亡的作用，我們將過表達ISG12a的Huh7細胞和沉默ISG12a的LH86細胞注射入免疫缺陷鼠皮下成瘤，然后通

8、過尾靜脈給小鼠注射TRAIL，觀察腫瘤體積變化。結果表明過表達ISG12a的Huh7細胞TRAIL處理后成瘤體積小于對照細胞，沉默ISG12a的LH86細胞TRAIL處理后腫瘤體積則大于對照細胞。通過TargetScan預測分析，ISG12a可能是miR-942的靶基因。通過雙熒光素酶報告和western blot實驗，我們證實miR-942通過調(diào)控ISG12a3’UTR抑制其蛋白表達。同時，我們發(fā)現(xiàn)miR-942與ISG12a在腫瘤細

9、胞系和腫瘤組織中存在負相關性。進一步研究發(fā)現(xiàn)Akt通過促進miR-942表達，抑制ISG12a的表達，進而影響肝癌細胞對TRAIL的敏感性。
　　為了研究肝癌細胞對TRAIL的獲得性耐藥機制，我們利用對TRAIL敏感的LH86細胞進行長期TRAIL處理，篩選得到耐藥株細胞，命名為LH86-TR。我們發(fā)現(xiàn)Akt活性在耐藥株細胞中降低，利用Akt特異性抑制劑無法逆轉(zhuǎn)細胞的耐藥性，表明Akt對LH86對TRAIL的獲得性耐藥沒有影響。通