IL-6-STAT3-Jagged-1-Notch環(huán)路調控胃癌細胞赫賽汀獲得性耐藥.pdf

1、胃癌是世界范圍內第二大常見的癌癥，每年新增病例約90萬。盡管過去的幾十年中，胃癌的發(fā)病率和死亡率在全球大部分地區(qū)已顯著下降，但是晚期胃癌病情的控制仍十分困難。
　　赫賽汀(Herceptin)是靶向人類表皮生長因子受體2(HER2)的治療性單克隆抗體，現(xiàn)為HER2陽性乳腺癌標準化治療的一線用藥。對于HER2陽性的晚期胃癌患者，赫賽汀與化療聯(lián)用亦有效。根據(jù)國際Ⅲ期赫賽汀臨床試驗結果，胃癌患者的反應率、中位無進展生存期、中位總生存期均

2、顯示臨床和統(tǒng)計學獲益。目前，赫賽汀已被批準用于HER2陽性晚期胃癌患者的臨床治療。
　　然而，赫賽汀耐藥是乳腺癌和胃癌治療中普遍存在的問題。HER2陽性胃癌患者約占25％，而患者對赫賽汀的反應率僅為12.8％，遠低于在乳腺癌中的報道。已知的赫賽汀耐藥機制主要來自乳腺癌研究的發(fā)現(xiàn)，包括PI3K信號通路過度活化、PTEN（磷酸酶和張力酶同源物）缺失、PI3K的催化亞基PIK3CA突變。然而，有關胃癌的赫賽汀原發(fā)性和獲得性耐藥機制鮮有報

3、道。
　　本研究中，通過對胃癌細胞進行梯度加壓誘導，建立了赫賽汀耐藥的胃癌細胞株NCI-N87-R和MKN-45-R。細胞增殖活性分析結果表明，NCI-N87-R和MKN-45-R細胞已獲得顯著的赫賽汀抗性。光學顯微鏡下可觀察到，耐藥細胞的形態(tài)發(fā)生了明顯的改變，Western blot和免疫熒光標記研究發(fā)現(xiàn)，耐藥細胞中上皮標志性蛋白E-鈣黏蛋白(E-cadherin)、緊密連接蛋白-1(ZO-1)的表達明顯下調，而間質標志性蛋白波

4、形蛋白(Vimentin)的表達則明顯升高，上皮-間質轉化(epithelial to mesenchymal transition，EMT)的重要調控分子ZEB1、Slug、Snail的表達亦上調，提示耐藥細胞發(fā)生了EMT。進一步通過細胞遷移實驗、三維培養(yǎng)、失巢凋亡、軟瓊脂集落形成、裸鼠體內成瘤等實驗，證實耐藥胃癌細胞的遷移能力、侵襲性、轉移能力和致瘤原性均顯著增強，表明赫賽汀長期處理導致胃癌細胞產生了藥物抗性及獲得了惡性表型。

5、>　　EMT可賦予腫瘤干細胞（Cancer Stem Cell，CSC）的特性，如自我更新、分化、對放化療耐藥等。有研究表明，CD44+的胃癌細胞具有CSC樣特征。對NCI-N87-R細胞進行了實時定量RT-PCR和流式細胞分析，發(fā)現(xiàn)NCI-N87-R細胞中CD44蛋白和mRNA水平均顯著升高。細胞微球形成實驗結果表明，NCI-N87-R細胞的自我更新能力顯著增強。此外，NCI-N87-R細胞中其它干細胞相關蛋白（CD133和OCT4）

6、的表達亦明顯升高。在MKN-45-R細胞中獲得了相同的結果。動物實驗研究結果證實，NCI-N87-R細胞的致瘤原性顯著增強，接種5×103個即可在動物體內成瘤，提示赫賽汀耐藥的胃癌細胞已獲得了CSC樣表型。
　　為了闡明胃癌細胞赫賽汀耐藥的分子機制，檢測了赫賽汀耐藥的胃癌細胞中HER2介導的幾個重要生存信號通路(AKT、ERK和STAT3)的活化。在母本細胞中，HER2下游的ERK及AKT呈明顯活化，而STAT3的磷酸化水平較低。

7、然而，在NCI-N87-R細胞中，AKT的活化幾乎被完全抑制，而STAT3呈異?；罨?。雙熒光素酶報告基因分析結果顯示，NCI-N87-R細胞中STAT3的活性明顯增強。應用WP1066阻斷Jak2/STAT3信號，可顯著抑制耐藥細胞的增殖，并恢復耐藥細胞對赫賽汀的敏感性。這些研究結果提示，母本細胞賴以生存的信號在耐藥過程中發(fā)生了明顯偏轉，STAT3信號異?；罨谖赴┘毎召愅∧退幹邪l(fā)揮關鍵的作用。
　　STAT3信號通路活化與多種

8、腫瘤的發(fā)生、轉化、侵襲和轉移密切相關。炎性細胞因子IL-1β、TNF-α和IL-6等可直接或間接激活STAT3信號，誘導腫瘤細胞發(fā)生EMT和CSC轉化。通過實時定量RT-PCR和ELISA分析，發(fā)現(xiàn)NCI-N87-R細胞中IL-6 mRNA的表達水平增加了上百倍。在母本細胞中，IL-6的分泌在檢測限以下，而在耐藥細胞中，IL-6的分泌則高達7000 pg/mL。IL-6刺激可誘導NCI-N87和NCI-Ng7-R細胞中STAT3磷酸化，

9、并可明顯拮抗赫賽汀對NCI-N87細胞的增殖抑制作用;抑制STAT3信號可增強NCI-N87-R細胞對赫賽汀的敏感性，促進耐藥細胞凋亡，提示IL-6大量分泌導致STAT3持續(xù)活化可能是胃癌細胞對赫賽汀產生抗性的重要原因。
　　近年來，Notch信號通路在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的重要性逐漸被研究者所認識。在乳腺癌細胞中，IL-6是Notch信號通路的靶基因，而Notch活化可促進IL-6表達。為了探索導致赫賽汀耐藥細胞中IL-6表達上調的原

10、因，觀察了Notch信號在赫賽汀耐藥的胃癌細胞中是否發(fā)生了變化。實時定量RT-PCR及啟動子活性分析結果顯示，耐藥細胞中Notch蛋白的表達及轉錄激活活性均明顯增強。應用γ分泌酶抑制劑抑制Notch胞內信號活化可顯著降低IL-6 mRNA的表達，表明耐藥細胞中IL-6過表達與Notch活化有關。Western blot分析結果表明，IL-6刺激可上調NCI-N87細胞中Notch配體Jagged-1表達，而STAT3抑制劑則可阻斷這一效

11、應，提示在NCI-N87細胞中存在IL-6/STAT3/Jagged-1信號軸。還發(fā)現(xiàn)，在NCI-N87細胞中過表達Jagged-1可上調IL-6及Notch的靶基因HEY1、HEY2表達，證實胃癌細胞中IL-6是Notch下游的靶基因， Jagged-1、Notch、IL-6在耐藥的胃癌細胞中構成正反饋環(huán)路，抑制Notch信號可增強耐藥細胞對赫賽汀的敏感性。此外，在細胞三維培養(yǎng)和微球形成實驗中，同時阻斷STAT3和Notch信號可顯著

12、抑制耐藥細胞的侵襲表型及CSC樣特性。以上結果證實，IL-6/STAT3/Jagged-1/Notch正反饋信號通路在胃癌細胞赫賽汀耐藥過程中發(fā)揮關鍵的作用。
　　綜上所述，研究結果揭示:(1)赫賽汀長期處理可誘導胃癌細胞產生抗性。(2) IL-6/STAT3/Jagged-1/Notch信號軸活化可能是胃癌獲得性赫賽汀耐藥的一個重要機制。(3)聯(lián)合阻斷STAT3和Notch信號可能成為預防或延緩赫賽汀耐藥的有效策略。本研究為提高