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文檔簡介
1、目的:
探討IL-6/STAT3炎性信號通路(Interleukin-6/Signaltransducerandactivatoroftranscription3inflammatorysignallingpathway)調(diào)控SATB1(specialATrichsequencebindingprotein)表達(dá)及對乳腺癌干細(xì)胞(breastcancerstemcell)自我更新能力的影響。
方法:
(1)
2、將MCF-7細(xì)胞進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)、傳代。通過轉(zhuǎn)染預(yù)實驗,驗證STAT3的慢病毒表達(dá)載體及STAT3的RNAi慢病毒表達(dá)載體(上海吉凱基因化學(xué)技術(shù)有限公司提供)轉(zhuǎn)染效率,并篩選出對STAT3干擾效率最高的慢病毒載體。
(2)應(yīng)用STAT3的慢病毒表達(dá)載體及STAT3的RNAi慢病毒表達(dá)載體并分別轉(zhuǎn)染MCF-7細(xì)胞,同時設(shè)置空白對照組、2個空包病毒組對照組。
?。?)采用無血清懸浮培養(yǎng)并添加IL-6的方法誘導(dǎo)建立乳腺癌干細(xì)胞的
3、體外模型,檢測同等數(shù)量的MCF-7細(xì)胞(空白組)、MCF-7/STAT3干擾組(26100)、MCF-7/空包病毒組對照組(CON077及CON235)和MCF-7/STAT3過表達(dá)組(14233)細(xì)胞中形成乳腺癌干細(xì)胞的微球體的數(shù)量和直徑大?。ǚ从臣?xì)胞中乳腺癌干細(xì)胞數(shù)量多少和自我更新能力的強弱)。
(4)收集上述5組微球體重新消化成單細(xì)胞懸液,采用CCK-8方法檢測MCF-7細(xì)胞(空白組)、MCF-7/STAT3干擾組(26
4、100)、MCF-7/空包病毒組對照組(CON077及CON235)和MCF-7/STAT3過表達(dá)組(14233)細(xì)胞的增殖活力。
?。?)采用熒光定量RT-PCR檢測上述5組微球體中STAT3mRNA及SATB1mRNA表達(dá)水平,Westernblot檢測STAT3,pSTAT3及SATB1蛋白表達(dá)水平。
?。?)通過流式細(xì)胞術(shù)檢測5組微球體中CD44+CD24-癌干細(xì)胞所占比例。
結(jié)果:
?。?)M
5、CF-7細(xì)胞基本呈多邊形,梭形、成片貼壁生長。通過轉(zhuǎn)染預(yù)實驗篩選出對MCF-7細(xì)胞的STAT3干擾效率最高的質(zhì)粒是26100:相對于對照組CON077,18940、18942和26100組的STAT3表達(dá)均有下降,分別下調(diào)了28%、38%和66%,但是26100的抑制效率最好,具有顯著性差異(P<0.05,n=3)。分組采用STAT3干擾載體26100用于干擾組。
?。?)細(xì)胞成球能力檢測結(jié)果:5組細(xì)胞采用無血清懸浮培養(yǎng)并添加I
6、L-6連續(xù)誘導(dǎo)7d后,形成富集了乳腺癌干細(xì)胞的乳腺微球體,其中14233組細(xì)胞形成的微球體直徑顯著較大,數(shù)量顯著增多,26100組細(xì)胞形成的微球體直徑顯著減小,數(shù)量顯著減少,其余三組居中。
(3)CCK8細(xì)胞增殖活力檢測結(jié)果:與MCF-7組比較,MCF-7/STAT3過表達(dá)組(14233)微球體細(xì)胞增殖活力升高(P﹤0.01),MCF-7/STAT3干擾組(26100)微球體細(xì)胞增殖活力下降(P﹤0.01),MCF-7組與兩陰
7、性病毒對照組之間微球體細(xì)胞增殖活力無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。
?。?)IL-6/STAT3炎性信號通路關(guān)鍵組件及SATB1基因檢測結(jié)果:QRT-PCR檢測示:14233組與對應(yīng)的空包病毒組CON235比較,其STAT3mRNA與SATB1mRNA均表達(dá)上調(diào)(P﹤0.01);26100組與對應(yīng)的空包病毒組CON077比較,其STAT3mRNA與SATB1mRNA均表達(dá)下調(diào)(P﹤0.01);與MCF-7組比較,CON077及CO
8、N235組的STAT3mRNA及SATB1mRNA的表達(dá)變化無統(tǒng)計學(xué)差異,(P﹥0.05)。Westernblot檢測示:14233組STAT3,pSTAT3及SATB1蛋白表達(dá)高于空白對照組MCF-7、空包病毒組(CON077,CON235)和干擾組26100(P<0.05),且空白對照組MCF-7、空包病毒組(CON077,CON235)組STAT3,pSTAT3及SATB1蛋白表達(dá)高于干擾組26100(P<0.05);陰性病毒對照
9、組(CON077,CON235)組與空白對照組MCF-7比較:STAT3,pSTAT3及SATB1蛋白表達(dá)變化無統(tǒng)計學(xué)差異(P﹥0.05)。
(5)流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果:5組微球體中14233組CD44+CD24-癌干細(xì)胞比例最高:56.43±2.85%;26100組最低:3.32±0.77%;其余三組居中分別為MCF-7組:12.41±1.53%;CON077組:13.33±2.01%;CON235組:13.58±2.35%,
10、14233組與MCF-7組,CON235組,CON077組及26100組比較其CD44+CD24-癌干細(xì)胞比例升高,P<0.05;26100組與MCF-7組,CON235組及CON077組比較其CD44+CD24-癌干細(xì)胞比例降低,P<0.05;MCF-7組,CON235組及CON077組之間CD44+CD24-癌干細(xì)胞比例變化無統(tǒng)計學(xué)差異,P﹥0.05。
結(jié)論:
?。?)IL-6/STAT3通路激活可以誘導(dǎo)乳腺癌干細(xì)
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