2023年全國(guó)碩士研究生考試考研英語(yǔ)一試題真題(含答案詳解+作文范文)_第1頁(yè)
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文檔簡(jiǎn)介

1、第一部分 B7-H4在小鼠食管癌前病變進(jìn)程中的表達(dá)
  目的:食管鱗狀細(xì)胞癌(esohaphageal squamous cell carcinoma, ESCC)是嚴(yán)重威脅人類生命及健康的癌癥之一。由于大部分患者在確診時(shí)已是中晚期,沒(méi)有顯著有效的治療措施,ESCC的預(yù)后一直較差,5年生存率約為20%。食管癌前病變是正常食管向ESCC轉(zhuǎn)變過(guò)程中的一種組織病理異常。如果接受恰當(dāng)?shù)脑\斷和治療,食管癌前病變預(yù)后較好,5年生存率可超過(guò)90

2、%。因此,預(yù)防和治療食管癌前病變是降低ESCC發(fā)病率和致死率的重要措施。協(xié)同刺激分子B7-H4是B7家族重要成員,在多種腫瘤組織中高表達(dá),并與預(yù)后呈負(fù)相關(guān)。為了研究食管癌前病變的發(fā)病機(jī)制,探討B(tài)7-H4在食管癌前病變進(jìn)程中的作用,本文擬采用4NQO飲水法誘導(dǎo)建立小鼠食管癌前病變模型,觀察食管癌前病變自然進(jìn)程中的組織病理改變,研究 B7-H4在小鼠食管癌前病變形成過(guò)程中的表達(dá)變化,及與腫瘤微環(huán)境中的相關(guān)淋巴細(xì)胞和細(xì)胞因子表達(dá)的關(guān)系,為評(píng)價(jià)

3、其能否成為食管癌前病變?cè)\斷和治療的新靶標(biāo)奠定基礎(chǔ)。
  方法:
  1通過(guò)4NQO飲水法誘導(dǎo)小鼠食管癌前病變模型,觀察病變過(guò)程中小鼠一般狀態(tài)及體重變化,并通過(guò)HE染色法評(píng)價(jià)食管癌前病變自然進(jìn)程中食管組織的病理改變。
  2通過(guò)免疫組織化學(xué)染色技術(shù)評(píng)價(jià)小鼠食管癌前病變自然進(jìn)程中B7-H4在食管上皮細(xì)胞的表達(dá),以及 CD4+T、CD8+T、CD11b+巨噬細(xì)胞在食管上皮組織的浸潤(rùn),并分析 B7-H4表達(dá)與淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)之間的

4、相關(guān)性。
  3通過(guò)qPCR、Western blot和ELISA方法檢測(cè)食管癌前病變進(jìn)程中B7-H4、IL-6、IL-10、TGF-β、IFN-γ、total STAT3和p-STAT3的表達(dá),并分析其相關(guān)性。
  4通過(guò)ELISA和Western blot方法檢測(cè)小鼠食管癌前病變進(jìn)程中血清B7-H4(sB7-H4)和鱗狀細(xì)胞癌抗原-2(SCCA-2)的表達(dá),并分析其與病變程度的相關(guān)性。
  結(jié)果:
  1小鼠

5、體重變化
  誘癌前,小鼠狀態(tài)良好。隨著誘癌時(shí)間的延長(zhǎng),對(duì)照組動(dòng)物狀態(tài)良好,飲食飲水正常,4NQO小鼠飲食飲水逐漸減少,一般狀態(tài)逐漸變差。另外,對(duì)照組小鼠體重增長(zhǎng)正常。而與對(duì)照組相比,4NQO誘癌組動(dòng)物體重增長(zhǎng)緩慢,特別是在17周之后,4NQO誘癌組雌性和雄性動(dòng)物體重均逐漸降低,而且分別顯著低于對(duì)照組雌性和雄性動(dòng)物體重。
  2小鼠食管組織病變特點(diǎn)
  從誘癌16周至28周,4NQO誘癌組小鼠食管組織出現(xiàn)肉眼可見(jiàn)的不同

6、程度的病理改變,包括上皮組織增厚,表面粗糙、凹凸不平,及腫塊。隨著誘癌時(shí)間的延長(zhǎng),病變程度逐漸增加。
  3 HE染色評(píng)價(jià)食管組織病理改變
  在整個(gè)誘癌過(guò)程中,4NQO誘癌小鼠食管組織經(jīng)歷了從正常食管、低級(jí)別上皮內(nèi)瘤變(LGIN)至高級(jí)別上皮內(nèi)瘤變(HGIN)的病理改變過(guò)程。小鼠食管組織病理改變與誘癌時(shí)間呈顯著正相關(guān),χ2=33.5476, P<0.0001。另外,Kruskal-Wallis分析結(jié)果表明,雌雄小鼠食管組織

7、病理改變無(wú)顯著差異,P>0.05。
  4免疫組化檢測(cè)B7-H4及淋巴細(xì)胞表達(dá)變化
  B7-H4表達(dá)于上皮細(xì)胞的胞漿和胞膜。根據(jù)評(píng)分結(jié)果,22例正常食管組織只有2例B7-H4高表達(dá)(9.1%)。食管癌前病變組織中,27例LGIN食管組織有11例B7-H4高表達(dá)(40.7%),21例HGIN食管組織有17例B7-H4高表達(dá)(81.0%)。Spearman相關(guān)性分析表明,B7-H4表達(dá)與病理級(jí)別呈顯著正相關(guān)( P<0.0001

8、),而與小鼠性別無(wú)顯著相關(guān)性( P=0.2959)。
  CD4、CD8和CD11b分別是CD4+T, CD8+T和巨噬細(xì)胞表面表達(dá)的膜分子。三種淋巴細(xì)胞主要浸潤(rùn)于食管上皮組織的粘膜下層,而在粘膜層浸潤(rùn)較少。另外,B7-H4表達(dá)與CD11b巨噬細(xì)胞在粘膜下層的浸潤(rùn)呈顯著正相關(guān)(P=0.0002),而與CD4+T和CD8+T浸潤(rùn)無(wú)顯著相關(guān)性(P=0.8507,P=0.3166)。
  5 qPCR檢測(cè)B7-H4及相關(guān)細(xì)胞因子和

9、STAT3表達(dá)
  與對(duì)照組相比,隨著誘癌時(shí)間的延長(zhǎng),4NQO小鼠食管組織B7-H4、IL-6、IL-10、TGF-β基因表達(dá)逐漸提高,特別是26周和28周,上述基因表達(dá)顯著提高,且均具有顯著性差異。另外,通過(guò)Spearman相關(guān)性分析, B7-H4與IL-6(r=0.5952,P<0.0001),IL-10(r=0.6561,P<0.0001), TGF-β(r=0.6586,P<0.0001)呈顯著正相關(guān)。然而,IFN-γ和S

10、TAT3基因表達(dá)升高不明顯。
  6 Western blot和ELISA法檢測(cè)B7-H4與相關(guān)蛋白表達(dá)
  與對(duì)照組比較,隨著誘癌時(shí)間的延長(zhǎng),4NQO誘癌組小鼠食管組織B7-H4和IL-6蛋白表達(dá)逐漸提高,特別是26周和28周,兩種蛋白提高具有顯著性差異,P<0.05,P<0.01。另外,與對(duì)照組相比,4NQO誘癌組小鼠食管組織28周p-STAT3表達(dá)顯著提高,P<0.01。另一方面,在整個(gè)誘癌過(guò)程中,B7-H4的表達(dá)與I

11、L-6或p-STAT3的表達(dá)呈顯著正相關(guān),(r=0.6145,P<0.0001; r=0.6180,P<0.0001)。總之,結(jié)果表明,在小鼠食管癌前病變形成的過(guò)程中,B7-H4表達(dá)與IL-6/STAT3信號(hào)通路活化呈正相關(guān)。
  7 Western blot和ELISA法檢測(cè)sB7-H4及SCCA-2蛋白表達(dá)
  與正常小鼠相比,HGIN小鼠血清中sB7-H4及SCCA-2蛋白濃度顯著提高,P<0.05,P<0.05。結(jié)果

12、提示,sB7-H4與SCCA-2蛋白相似,可能成為食管癌及癌前病變潛在的腫瘤標(biāo)志物。
  第二部分B7-H4活化IL-6/STAT3通路并促進(jìn)食管鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞增殖
  目的:
  為了進(jìn)一步研究 B7-H4參與食管癌前病變形成的作用機(jī)制,以及其表達(dá)改變對(duì) IL-6/STAT3信號(hào)通路的作用,本部分內(nèi)容研究了 B7-H4對(duì)Eca109、TE1和 TE13三種 ESCC細(xì)胞生物學(xué)功能的影響,以及其與IL-6/STAT3信

13、號(hào)通路活化之間的關(guān)系。
  方法:
  1 MTS細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)
  收集空白對(duì)照和敲低B7-H4的ESCC細(xì)胞,接種于96孔板,在接種后的0 h、24 h、48 h、72 h,每孔加入20μl MTS染色液,用酶標(biāo)儀在490 nm測(cè)定吸光度值,檢測(cè)細(xì)胞的增殖率。
  2克隆形成實(shí)驗(yàn)
  收集空白對(duì)照和敲低B7-H4的ESCC細(xì)胞,接種入3cm直徑的培養(yǎng)皿,常規(guī)培養(yǎng)12天,計(jì)數(shù)細(xì)胞克隆數(shù)。
  3流式細(xì)

14、胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期
  收集空白對(duì)照和敲低B7-H4的ESCC細(xì)胞,通過(guò)PI染色,用流式細(xì)胞儀檢測(cè)DNA含量分布,分析細(xì)胞周期特點(diǎn)。
  4流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡
  收集空白對(duì)照和敲低B7-H4的ESCC細(xì)胞,通過(guò)Annexin-Ⅴ和7-AAD染色,在流式細(xì)胞儀上檢測(cè)細(xì)胞凋亡特點(diǎn)。
  5 qPCR和Western blot、ELISA法檢測(cè)B7-H4及相關(guān)分子表達(dá)
  收集空白對(duì)照和敲低B7-H4的ESC

15、C細(xì)胞,通過(guò)qPCR和Western blot方法檢測(cè)B7-H4、IL-6、STAT3、p-STAT3、JAK2、p-JAK2、Bcl-2、BAX和Survivin的表達(dá)。
  6免疫熒光染色和Western blot檢測(cè)total STAT3和p-STAT3在胞漿和胞核的定位
  收集空白對(duì)照和敲低B7-H4的ESCC細(xì)胞,通過(guò)免疫熒光染色技術(shù)觀察total STAT3和p-STAT3在細(xì)胞漿和細(xì)胞核的分布。收集空白對(duì)照和

16、敲低B7-H4的ESCC細(xì)胞,分別提取細(xì)胞漿和細(xì)胞核的蛋白,通過(guò)Western blot方法檢測(cè)total STAT3和p-STAT3在細(xì)胞漿和細(xì)胞核的表達(dá)。
  7 AG490對(duì)B7-H4沉默抑制IL-6分泌的作用
  將40μM AG490(JAK2/STAT3抑制劑)處理的細(xì)胞,轉(zhuǎn)染control shRNA或B7-H4 shRNA,48 h后收集上清液,通過(guò)ELISA方法檢測(cè)細(xì)胞上清液IL-6濃度。
  8 T

17、ocilizumab對(duì)B7-H4沉默抑制JAK2/STAT3活化的作用
  將200 ng/ml Tocilizumab(IL-6受體阻斷劑)處理的細(xì)胞轉(zhuǎn)染control shRNA或B7-H4 shRNA,48 h后收集細(xì)胞,通過(guò)Western blot方法檢測(cè)total JAK2、 p-JAK2、total STAT3、p-STAT3的蛋白表達(dá)。
  結(jié)果:
  1 B7-H4在ESCC細(xì)胞高表達(dá)
  Eca

18、109、TE1和TE13均為ESCC細(xì)胞。其中,Eca109和TE13為高分化,TE13為低分化。B7-H4在人正常食管組織幾乎不表達(dá)。與正常食管組織相比,B7-H4在Eca109、TE1和TE13三種細(xì)胞均高表達(dá),而且, B7-H4在Eca109、TE1和TE13表達(dá)水平相似,無(wú)顯著性差異,P>0.05。
  2 B7-H4沉默抑制細(xì)胞增殖及克隆形成
  MTS實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,與control shRNA處理組相比,B7-H

19、4 shRNA處理的Eca109、TE1和TE13細(xì)胞在接種后48 h和72 h增殖率都顯著降低??寺⌒纬蓪?shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,與control shRNA處理細(xì)胞相比,B7-H4沉默可顯著降低Eca109、TE1和TE13細(xì)胞的克隆數(shù),P值分別為<0.05,<0.001,<0.001。
  3 B7-H4對(duì)ESCC細(xì)胞周期的影響
  與空白對(duì)照細(xì)胞相比,B7-H4 shRNA處理的 Eca109、TE1和 TE13細(xì)胞G1期比例顯

20、著提高,P值均為<0.05,而S期和G2期比例有一定程度的降低,但無(wú)顯著性差異, P值均>0.05。
  4 B7-H4對(duì)ESCC細(xì)胞凋亡的影響
  與空白對(duì)照相比,B7-H4敲低的Eca109、TE1和TE13細(xì)胞總凋亡率顯著提高,P<0.001,<0.01,和<0.05。另外,與空白對(duì)照相比,B7-H4敲低的細(xì)胞早期凋亡和晚期凋亡率也分別有一定程度的提高,P<0.05或P<0.01。
  5 B7-H4對(duì)ESCC細(xì)

21、胞凋亡相關(guān)分子表達(dá)的影響
  與空白對(duì)照相比,B7-H4低表達(dá)的ESCC細(xì)胞表現(xiàn)為顯著的凋亡抑制分子Bcl-2和Survivin表達(dá)下調(diào),以及凋亡促進(jìn)分子BAX的表達(dá)上調(diào),P<0.01或P<0.001。
  6 B7-H4對(duì)ESCC細(xì)胞IL-6分泌的影響
  與空白對(duì)照相比,B7-H4敲低的Eca109、TE1和TE13細(xì)胞上清液IL-6濃度顯著降低,P<0.05,P<0.01,或P<0.01。
  7 B7-H

22、4對(duì)JAK2、STAT3活化的影響
  與空白對(duì)照相比,B7-H4敲低的Eca109、TE1和TE13細(xì)胞總STAT3的表達(dá)無(wú)顯著差異,而p-STAT3(STAT3的活化形式)的表達(dá)顯著降低, P均<0.001。另外,B7-H4沉默可顯著降低Eca109、TE1和TE13細(xì)胞p-JAK2的表達(dá),而對(duì)總JAK2表達(dá)無(wú)影響,P<0.01,P<0.05,P<0.01。由此可知,B7-H4在JAK2/STAT3信號(hào)通路活化中起重要作用。<

23、br>  8 B7-H4對(duì)STAT3和p-STAT3核漿轉(zhuǎn)位的影響
  B7-H4敲低后可顯著降低p-STAT3在Eca109、TE1和TE13細(xì)胞核的表達(dá)(P<0.01,P<0.05,P<0.05),而對(duì)其在細(xì)胞漿的表達(dá)無(wú)顯著影響,P均>0.05。另外,B7-H4敲低對(duì)總STAT3在細(xì)胞漿及細(xì)胞核的表達(dá)均無(wú)顯著影響,P均>0.05。
  9 AG490阻斷了B7-H4敲低對(duì)IL-6分泌的抑制作用
  與空白對(duì)照細(xì)胞相

24、比,B7-H4 shRNA處理的 Eca109、TE1和TE13細(xì)胞IL-6分泌顯著降低,P<0.01,P<0.01,P<0.001。而與control shRNA和AG490合用處理組相比,B7-H4 shRNA和AG490處理的Eca109、TE1和TE13細(xì)胞IL-6分泌無(wú)顯著差異,P均>0.05。上述結(jié)果提示B7-H4敲低是通過(guò)抑制STAT3的活化進(jìn)而抑制IL-6的分泌。
  10 Tocilizumab不能阻斷B7-H4

25、敲低對(duì)JAK2/STAT3活化的抑制作用與空白對(duì)照細(xì)胞相比,B7-H4 shRNA處理的 TE13細(xì)胞 p-JAK2和p-STAT3表達(dá)顯著降低, P<0.05, P<0.05。與 control shRNA和Tocilizumab單獨(dú)處理組相比,B7-H4 shRNA與Tocilizumab處理的TE13細(xì)胞p-JAK2和p-STAT3表達(dá)也顯著降低,P<0.05,P<0.05。結(jié)果提示無(wú)論是否存在IL-6, B7-H4敲低均直接抑制

26、了JAK2/STAT3的活化。
  第三部分IL-6促進(jìn)食管鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞增殖及與B7-H4表達(dá)的關(guān)系
  目的:
  為了進(jìn)一步闡明B7-H4促進(jìn)IL-6分泌是否是B7-H4促進(jìn)ESCC細(xì)胞增殖的分子機(jī)制,以及B7-H4的表達(dá)是否受IL-6的影響,本部分內(nèi)容研究了IL-6促進(jìn)ESCC細(xì)胞增殖的作用及與B7-H4分子表達(dá)的關(guān)系。
  方法:
  1 IL-6對(duì)ESCC細(xì)胞增殖的影響
  收集Eca10

27、9、TE1和TE13細(xì)胞,以4000個(gè)細(xì)胞/孔接種入96孔板,分別加入含0、10、20、40 ng/ml IL-6蛋白的培養(yǎng)基,通過(guò)MTS實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞的增殖能力。
  2 Tocilizumab對(duì)ESCC細(xì)胞增殖的影響
  收集control shRNA和B7-H4 shRNA處理的Eca109、TE1和TE13細(xì)胞,以4000個(gè)細(xì)胞/孔分別接種入96孔板,用含或不含Tocilizumab(200 ng/ml)培養(yǎng)基培養(yǎng)。通

28、過(guò)MTS和克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞的增殖和克隆形成能力。
  3 IL-6對(duì)ESCC細(xì)胞B7-H4表達(dá)的影響
  收集Eca109、TE1和TE13細(xì)胞,分別加入含或不含40 ng/ml IL-6蛋白的培養(yǎng)基孵育48 h。收集細(xì)胞,通過(guò)Western blot方法檢測(cè)B7-H4表達(dá)。
  4 Tocilizumab對(duì)ESCC細(xì)胞B7-H4表達(dá)的影響
  收集Eca109、TE1和TE13細(xì)胞,以5×105細(xì)胞/孔接種

29、入6孔板,分別加入含或不含200 ng/ml人IL-6受體阻斷劑Tocilizumab的培養(yǎng)基孵育48 h。收集細(xì)胞,通過(guò)Western blot方法考察B7-H4表達(dá)。
  結(jié)果:
  1 IL-6不能促進(jìn)ESCC細(xì)胞增殖
  與空白對(duì)照組相比,10、20和40 ng/ml的IL-6處理的Eca109、TE1和TE13細(xì)胞增殖率無(wú)明顯差異,P均>0.05。
  2 Tocilizumab抑制ESCC細(xì)胞增殖及克

30、隆形成
  200 ng/ml的Tocilizumab可顯著抑制Eca109、TE1和TE13細(xì)胞增殖率和克隆數(shù)。
  3 Tocilizumab不能抑制B7-H4敲低的ESCC細(xì)胞增殖及克隆形成
  與 B7-H4敲低單獨(dú)處理的細(xì)胞相比,200 ng/ml的 Tocilizumab對(duì)B7-H4敲低的Eca109、TE1和TE13細(xì)胞增殖率和克隆數(shù)無(wú)顯著影響,P均>0.05。
  4 IL-6不能誘導(dǎo)ESCC細(xì)胞

31、B7-H4的表達(dá)
  40 ng/ml IL-6對(duì)Eca109、TE1和TE13細(xì)胞B7-H4的表達(dá)無(wú)影響,P均>0.05。
  5 Tocilizumab抑制ESCC細(xì)胞B7-H4的表達(dá)
  與正常ESCC細(xì)胞相比,Tocilizumab可顯著降低B7-H4在Eca109、TE1和TE13細(xì)胞的表達(dá),P分別為<0.05,<0.001和<0.01。
  結(jié)論:
  14NQO飲水法可成功誘導(dǎo)小鼠食管癌前病變

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