GPER蛋白介導子宮內膜癌中IL-6-STAT3信號通路的激活.pdf

1、目的：子宮內膜癌是發(fā)生于子宮內的一種上皮性惡性腫瘤，為女性生殖系統(tǒng)中最常見的惡性腫瘤之一。根據(jù)臨床及病理觀察結果將子宮內膜癌分為：Ⅰ型和Ⅱ型。Ⅰ型為雌激素依賴型癌，最常見的病理類型為子宮內膜樣腺癌，這種類型大多數(shù)伴有前期子宮內膜增生和(或)子宮內膜上皮內瘤變，在持續(xù)單一雌激素刺激下產生。Ⅱ型為非激素依賴型癌，與臨床雌激素刺激無關，主要源自萎縮或靜止的子宮內膜，最常見的病理類型包括漿液性乳頭狀腺癌、透明細胞癌和癌肉瘤。Ⅱ型子宮內膜癌細胞異

2、型性大，進展快，易出現(xiàn)深肌層浸潤及淋巴結轉移。關于Ⅱ型子宮內膜癌的信號傳導通路是國內外研究熱點，雌激素如何導致Ⅱ型子宮內膜癌的發(fā)生尚需深入研究。
　　G蛋白偶聯(lián)雌激素受體(G-protein coupled estrogen receptor, GPER)是一種膜結合的雌激素結合蛋白，其作用方式與經(jīng)典的雌激素受體不同，主要通過介導雌激素作用活化其下游的快速非基因組信號通路(non-genomic signaling)，其中包括MA

3、PK/ERK、PI3K/AKT、cAMP、鈣離子流動等發(fā)揮細胞生長、遷移、侵襲、血管形成等惡性生物學效應。由于能夠與雌激素及其相關化合物結合介導快速非基因組效應,廣泛參與調節(jié)身體各項生理活動，其結構、定位、相關信號轉導通路以及與雌激素相關疾病的關系引起了研究者們的廣泛關注。
　　炎癥微環(huán)境是腫瘤的重要特征之一，IL-6(interleukin-6)最早是由Muraguch等命名為T細胞替代因子，既可由淋巴細胞(如T細胞、B細胞)分

4、泌,也可由非淋巴細胞(如成纖維細胞、巨噬細胞等)分泌。許多抗原和非抗原性物質也可誘導、刺激IL-6的分泌,如細菌內毒素、一些中藥單體和細胞因子等。信號轉導和轉錄激活因子3(signal transducers and activators of transcription3,STAT3)是一類雙功能分子，既可以傳導細胞信號，又可以激活基因轉錄。IL-6激活其下游的STAT3，誘導和維持腫瘤的炎癥微環(huán)境，促進腫瘤的發(fā)生發(fā)展。研究表明，Ⅰ、

5、Ⅱ型子宮內膜癌患者血清中的IL-6均處于高水平，Ⅱ型子宮內膜癌高于Ⅰ型，提示IL-6/STAT3通路可能在Ⅱ型子宮內膜癌的基因調控中發(fā)揮重要作用。有研究證明了雌激素能夠通過MAPK/ERK信號通路促進細胞中IL-6的表達，故研究者推測，子宮內膜癌中可能存在GPER蛋白對IL-6/STAT3炎癥信號通路的調控作用。
　　本研究選用雌激素受體陽性表達的子宮內膜癌Ishikawa細胞、雌激素受體低表達的HEC-1A細胞、雌激素受體陰性的

6、KLE細胞為研究對象，在體外試驗中用17-β雌二醇(E2)、GPER特異性激動劑(G1)、GPER特異性拮抗劑(G15)處理細胞，檢測其細胞培養(yǎng)上清中IL-6含量及GPER、P-ERK、P-STAT3的蛋白表達水平，從而探討GPER蛋白對IL-6/STAT3信號通路的調控及該調控通路在子宮內膜癌發(fā)生發(fā)展的作用及可能的機制。
　　方法：
　　1細胞培育：人子宮內膜癌細胞株Ishikawa，以含有10％新生牛血清的1640培養(yǎng)基

7、培養(yǎng)；HEC-1A、KLE細胞株，以含有10%新生牛血清的McCoys5A培養(yǎng)基培養(yǎng)。兩種培養(yǎng)基中各加濃度為100U/ml的青霉素及鏈霉素的雙抗，培養(yǎng)于37℃、5%CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱內。以0.25%胰蛋白酶消化傳代，細胞呈單層貼壁生長。
　　2 ELISA法檢測細胞上清中IL-6的分泌量。待培養(yǎng)瓶中細胞生長至80%～90%后，更換無牛血清培養(yǎng)基培養(yǎng)24h，分別用E2、G1及G15處理Ishikawa、HEC-1A、KLE三種

8、細胞24h，調整終濃度達10-6mol/L，各組DMSO量至一致，最后得到對照組、E2處理組、G1處理組、E2+G15處理組、G1+G15處理組。收集細胞上清液，保存于-80℃冰箱，按ELISA試劑盒操作說明書檢測樣本。實驗重復3次。
　　3 Western Blot方法檢測17-β雌二醇(E2)、GPER特異性激動劑(G1)、GPER特異性拮抗劑(G15)作用下的三種子宮內膜癌細胞中 GPER、P-ERK、P-STAT3的蛋白表

9、達。
　　結果：
　　1 E2及GPER特異性激動劑G1通過活化膜性雌激素受體GPER促進Ishikawa、HEC-1A、KLE細胞表達IL-6。
　　ELISA法檢測E2及G1對三種細胞上清液中IL-6的促分泌作用。結果顯示，藥物處理24h后，Ishikawa細胞中，E2及G1均促進了細胞上清中IL-6的分泌量，其中E2作用較G1顯著（P<0.05）。HEC-1A及KLE細胞中，E2及G1均促進了細胞上清中IL-6的

10、分泌量，其中G1作用較E2顯著（P<0.05）。
　　以上結果說明E2及G1通過活化GPER蛋白促進了三種細胞中IL-6的表達。
　　2 GPER特異性拮抗劑G15對子Ishikawa、HEC-1A、KLE細胞中IL-6的抑制作用。
　　ELISA結果顯示E2+G15組、G1+G15組中E2和G1對細胞上清中IL-6的促進作用被顯著抑制(P＜0.05)，其中HEC-1A及KLE細胞抑制作用明顯。提示，HEC-1A及KL

11、E細胞中，E2和G1對細胞上清中IL-6的誘導作用主要通過GPER發(fā)揮作用。
　　3 Western Blot方法檢測E2及G1對三種細胞中GPER、P-ERK、P-STAT3蛋白的影響。
　　GPER、P-ERK、P-STAT3蛋白在三種細胞中均有表達。且在KLE細胞中表達量最高，差異有統(tǒng)計學意義。用濃度為10-6mol/L的E2及G1作用于三種細胞0min、15min、30min、45min、1h、2h，結果顯示：Ish

12、ikawa細胞中，E2促進了GPER、P-ERK、P-STAT3三種蛋白的表達，15min時開始升高，30min時達最高(P<0.05)。G1僅對GPER蛋白表達量有上調作用，對P-ERK、P-STAT3蛋白上調作用不明顯，說明在Ishikawa細胞中,E2主要通過ER介導的相關信號通路發(fā)揮作用，而GPER不起主要作用。HEC-1A及KLE細胞中，E2及G1對GPER、P-ERK、P-STAT3三種蛋白表達量均有上調作用，15min時達

13、最高，其中G1作用顯著，差異有統(tǒng)計學意義。
　　4 Western Blot方法檢測GPER特異性拮抗劑G15對E2及G1作用下的子宮內膜癌細胞中GPER、P-ERK、P-STAT3蛋白表達的影響。
　　用E2+G15、G1+G15分別處理Ishikawa細胞30min、處理HEC-1A及KLE細胞15min。結果顯示：G15對E2及G1作用下的HEC-1A、KLE細胞中三種蛋白的上調作用的抑制尤為明顯，差異具有統(tǒng)計學意義；

14、而對Ishikawa細胞中GPER蛋白表達有下調作用，對P-ERK、P-STAT3蛋白的表達無明顯下調作用(P>0.05)。提示，在HEC-1A、KLE細胞中，GPER、P-ERK、P-STAT3在一條信號通路上。
　　結論：
　　1 E2及G1通過活化膜性雌激素受體GPER促進細胞中IL-6的表達，且在HEC-1A及KLE細胞中，即Ⅱ型子宮內膜癌細胞中作用明顯。
　　2雌激素通過活化膜性雌激素受體GPER介導了子宮內