順鉑聯(lián)合蛋白酶休抑制劑殺傷骨肉瘤細(xì)胞的研究.pdf

1、順鉑是臨床上常用的廣譜抗癌藥物，是骨肉瘤聯(lián)合化療中有效的藥物之一。但由于的產(chǎn)生和自身的毒副作用，限制了順鉑的臨床使用，耐藥的產(chǎn)生與腫瘤細(xì)胞內(nèi)切除修復(fù)基因(ERCC-1)的水平上升有密切相關(guān)，如何降低腫瘤細(xì)胞內(nèi)ERCC-1的水平成了治療腫瘤的一個(gè)關(guān)鍵。泛素—蛋白酶體系統(tǒng)是生物體內(nèi)進(jìn)行蛋白質(zhì)選擇性降解的重要途徑之一，它參與了細(xì)胞內(nèi)許多重要的生理和生化過程。蛋白酶體抑制劑通過對泛素化通路的阻斷可誘導(dǎo)多種人腫瘤細(xì)胞凋亡，被認(rèn)為可發(fā)展為很有前途的

2、抗腫瘤藥物，有文獻(xiàn)表明蛋白酶體抑制劑通過降低腫瘤細(xì)胞內(nèi)ERCC-1水平來預(yù)防順鉑-DNA復(fù)合物的修復(fù)和促進(jìn)順鉑-DNA復(fù)合物的凋亡。但在骨與軟組織腫瘤方面國內(nèi)外文獻(xiàn)尚未見相關(guān)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)選用蛋白酶體抑制劑Z-LLL-CHO和順鉑，動(dòng)態(tài)觀察其對骨肉瘤細(xì)胞株MG-63的抑制作用，研究蛋白酶體抑制劑能否增加骨肉瘤細(xì)胞對順鉑的敏感性以及和順鉑能否協(xié)同誘導(dǎo)MG-63細(xì)胞凋亡，為篩選新的治療骨肉瘤的藥物提供參考。 實(shí)驗(yàn)方法 (1)四甲基偶

3、氮唑鹽(MTT)法檢測MG-63細(xì)胞的存活率，將MG-63細(xì)胞分為4組：第一組，經(jīng)一系列不同濃度的順鉑處理；第二組，在第一組基礎(chǔ)上加0.5umol/L的蛋白酶體抑制劑；第三組，在第一組基礎(chǔ)上加1.0umol/L的蛋白酶體抑制劑；第四組為未處理對照組。將細(xì)胞接種于96孔板，分別作用48、72小時(shí)后，加入MTT和二甲基亞砜，在570nm波長下測吸光度并計(jì)算細(xì)胞存活率。 (2)電鏡觀察細(xì)胞凋亡形態(tài)，將MG-63細(xì)胞分為三組：第一組，經(jīng)

4、一系列不同濃度的順鉑處理；第二組，在第一組基礎(chǔ)上加1.0umol/L的蛋白酶體抑制劑；第三組為未處理對照組。分別作用12、24、48小時(shí)后制備切片，用透射電鏡作亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)形態(tài)學(xué)觀察。 (3)流式細(xì)胞儀分析凋亡率，將MG-63細(xì)胞分為三組：第一組，經(jīng)10ug/ml濃度的順鉑處理；第二組，在第一組基礎(chǔ)上加1.0umol/L的蛋白酶體抑制劑；第三組為未處理對照組。分別作用12、24、48小時(shí)后，將細(xì)胞處理后上機(jī)檢測。(4)逆轉(zhuǎn)錄聚全酶

5、鏈反應(yīng)(RT-PCR)檢測切除修復(fù)基因-1(ERCC-1)的轉(zhuǎn)錄水平，細(xì)胞分組同流式細(xì)胞儀檢測，作用24小時(shí)后提取總RNA，作RT-PCRR反應(yīng)后再行瓊脂糖凝膠電泳分析，了解ERCC-1的水平。 結(jié)果 (1)MTT法顯示順鉑和蛋白酶體抑制劑對骨肉瘤細(xì)胞的毒性作用。細(xì)胞存活率在順鉑加蛋白酶體抑制劑較單用順鉑下降明顯，加1.0umol/L的蛋白酶體抑制劑比加0.5umol/L的蛋白酶體抑制劑更明顯。濃度為50ug/ml的順鉑，單獨(dú)

6、作用48小時(shí)細(xì)胞存活率為(64.66±0.05)％，同樣濃度的順鉑加0.5umol/L的蛋白酶體抑制劑作用48小時(shí)，細(xì)胞存活率為(56.38±0.03)％，72小時(shí)為(29.44±0.04)％，而同樣濃度的順鉑加1.0umol/L的蛋白酶體抑制劑作用48小時(shí)，細(xì)胞存活率就下降到(2.95±0.01)％。數(shù)據(jù)經(jīng)Dunnet-t分析顯示各組加藥組與對照組均存在著顯著性差異(P＜0.05)。 (2)順鉑和蛋白酶體抑制劑誘導(dǎo)骨肉瘤細(xì)胞凋

7、亡的形態(tài)學(xué)觀察。正常細(xì)胞形態(tài)規(guī)則，胞漿胞核完整，位于細(xì)胞中央，染色質(zhì)分布均勻。順鉑作用24h后表現(xiàn)為細(xì)胞凋亡改變：細(xì)胞皺縮，胞膜結(jié)構(gòu)保持完整，胞核表現(xiàn)為新月形胞核，位于胞漿邊緣，胞漿出現(xiàn)少許空泡。順鉑加蛋白酶體抑制劑后MG-63細(xì)胞表現(xiàn)出特征性的調(diào)亡形態(tài)：細(xì)胞體積變小，胞膜上有向外突起的調(diào)亡小體形成，新月形胞核，胞漿出現(xiàn)較多空泡。 (3)順鉑和蛋白酶體抑制劑誘導(dǎo)骨肉瘤細(xì)胞的調(diào)亡率。骨肉瘤細(xì)胞經(jīng)順鉑和蛋白酶體抑制劑作用24小時(shí)后調(diào)

8、亡率開始出現(xiàn)明顯改變。單獨(dú)順鉑作用后MG-63細(xì)胞的凋亡率為(14.37±2.37)％，順鉑和蛋白酶體抑制劑共同作用后凋亡率為(50.93±4.84)％，比前者有顯著提高(P＜0.05)。 (4)順鉑和蛋白酶體抑制劑對骨肉瘤細(xì)胞ERCC-1轉(zhuǎn)錄水平的影響。MG-63細(xì)胞經(jīng)順鉑作用后，ERCC-1的轉(zhuǎn)錄水平有了顯著增加，從0.45±0.06增加到0.53±0.10(P＜0.05)，而經(jīng)順鉑和蛋白酶體抑制劑聯(lián)合作用后，ERCC-1轉(zhuǎn)