鎘脅迫對(duì)香魚(yú)肝蛋白質(zhì)組學(xué)的影響【優(yōu)秀畢業(yè)設(shè)計(jì)】

1、<p><b>　　本科畢業(yè)設(shè)計(jì)</b></p><p><b>　　（20_ _屆）</b></p><p>　　鎘脅迫對(duì)香魚(yú)肝蛋白質(zhì)組學(xué)的影響</p><p>　　所在學(xué)院 </p><p>　　專(zhuān)業(yè)班級(jí) 水產(chǎn)養(yǎng)殖

2、學(xué) </p><p>　　學(xué)生姓名 學(xué)號(hào) </p><p>　　指導(dǎo)教師 職稱(chēng) </p><p>　　完成日期 年 月 </p><p><b>　　目 錄</b>&l

3、t;/p><p><b>　　摘要1</b></p><p><b>　　關(guān)鍵詞1</b></p><p><b>　　1 引言2</b></p><p><b>　　2 材料和方法2</b></p><p>　　2.1 實(shí)驗(yàn)材

4、料2</p><p>　　2.1.1 實(shí)驗(yàn)魚(yú)2</p><p>　　2.1.2 試劑與儀器2</p><p>　　2.2 實(shí)驗(yàn)方法3</p><p>　　2.2.1 染毒分組及取樣3</p><p>　　2.2.2 蛋白質(zhì)樣品的制備3</p><p>　　2.2.3 蛋白質(zhì)雙向電泳

5、3</p><p>　　2.2.4 圖象獲得及分析5</p><p>　　2.2.5 蛋白質(zhì)切膠及質(zhì)譜分析5</p><p><b>　　3 結(jié)果與討論5</b></p><p>　　3.1 對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組差異蛋白點(diǎn)的篩選及比較5</p><p>　　3.2 Cd脅迫條件下表達(dá)量上調(diào)的蛋白

6、質(zhì)7</p><p>　　3.3 Cd脅迫條件下表達(dá)量下調(diào)的蛋白質(zhì)7</p><p><b>　　3.4 討論7</b></p><p>　　3.4.1 氧化應(yīng)激7</p><p>　　3.4.2 甲基代謝8</p><p>　　3.4.3 核酸代謝8</p><p

7、>　　3.4.4 金屬代謝8</p><p>　　3.4.5 其他代謝8</p><p><b>　　4 小結(jié)8</b></p><p>　　致謝錯(cuò)誤!未定義書(shū)簽。</p><p><b>　　參考文獻(xiàn)9</b></p><p>　　附錄錯(cuò)誤!未定義書(shū)簽。&

8、lt;/p><p>　　摘要: 鎘是一種對(duì)生物組織器官有著廣泛的毒性損傷作用的化學(xué)污染物。對(duì)香魚(yú)(Plecoglossus altivelis)進(jìn)行急性鎘脅迫(5mg/L)處理。經(jīng)對(duì)肝組織的蛋白樣品通過(guò)雙向電泳進(jìn)行分離，并通過(guò)PDQuest軟件分析，找出27個(gè)差異點(diǎn)，經(jīng)基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-TOF-MS)或液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)分析以后，成功鑒定23個(gè)蛋白。這些蛋白基因包括在多種

9、生理過(guò)程中。熱休克蛋白70、谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶、醛脫氫酶三個(gè)蛋白主要包括在鎘誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激過(guò)程中，且蛋白表達(dá)量都為上升；鐵傳遞蛋白和碳酸酐酶包括在金屬代謝過(guò)程中；甲硫氨酸腺苷轉(zhuǎn)移酶和甜菜堿高半胱氨酸S-甲基轉(zhuǎn)移酶包括在甲基代謝中；2-氧代-4-羥基-4-羧基-5-脲基咪唑啉脫羧酶包含在核酸代謝中，以及其他蛋白涉及葡萄糖等生理代謝。這些基因可以進(jìn)一步研究做為鎘污染的生物標(biāo)記。</p><p>　　關(guān)鍵詞: 鎘；香魚(yú)；蛋

10、白質(zhì)組學(xué)；雙向電泳</p><p>　　Abstract: Cadmium(Cd) is such a toxic heavy metal to disrupt a variety of physiological processes. The liver proteome of Plecoglossus altivelis was analyzed through two-dimensional gel ele

11、ctrophoresis (2-DE) after acute Cd stress at 5mg/L .Protein spots obtained from Cd stress and control group were separated and analyzed by PDQuest. The expressions of 27 spots expressed differentially of low temperature

12、stress group varied significantly after challenge. 23 proteins were identified through MALDI</p><p>　　Key words: Cadmium;, ayu, proteomics, two dimensional gel electrophoresis</p><p><b>　　

13、1 引言</b></p><p>　　香魚(yú)(Plecoglossus altivelis)系鮭形目、香魚(yú)科、香魚(yú)屬，一年生降海洄游性魚(yú)類(lèi)，又稱(chēng)油香魚(yú)，為我國(guó)重要的小型名貴魚(yú)類(lèi)。隨著工業(yè)的快速發(fā)展，我國(guó)多個(gè)水域環(huán)境重金屬鎘污染日益嚴(yán)重，河流和河口是污染物的重要接受水體，含有豐富的重金屬。香魚(yú)作為浙江省重要經(jīng)濟(jì)魚(yú)類(lèi)其產(chǎn)量受到嚴(yán)重影響。</p><p>　　金屬可能對(duì)魚(yú)類(lèi)物種引起嚴(yán)重

14、后果，包括生長(zhǎng)阻滯、繁殖率下降和增加疾病敏感性 (Langston et al. 2002)。近年有研究標(biāo)明，繼汞、鉛之后鎘將是污染人類(lèi)環(huán)境、威脅人類(lèi)健康的第三個(gè)重要金屬元素。1993年世界腫瘤研究機(jī)構(gòu)(IARC)定義鎘為人類(lèi)致癌物(group I)。雖然國(guó)際上早已優(yōu)先研究的食品污染物鎘，但由于鎘在體內(nèi)的半衰期長(zhǎng)達(dá)幾十年，性質(zhì)穩(wěn)定且缺乏特效藥，因此鎘中毒的治療困難。Cd能對(duì)各種生理過(guò)程造成干擾(Koizumi et al. 1995)。

15、重金屬脅迫下，鎘可以直接作用于金屬硫蛋白(MT)基因的啟動(dòng)子，從而誘導(dǎo)肝臟和腎臟的MTmRNA的大量合成(劉偉成等, 2005)。Ranaldi 等發(fā)現(xiàn)鎘脅迫在耳石中有累積現(xiàn)象(Ranaldi et al, 2009)，但鎘被吸收進(jìn)人血液后，大部分存在于紅細(xì)胞中，與金屬硫蛋白結(jié)合鎘隨血液流動(dòng)選擇性多儲(chǔ)存于肝、腎(劉偉成等, 2005)。多有關(guān)于鎘脅迫對(duì)魚(yú)類(lèi)肝組織特定蛋白的影響的研究，如低濃度鎘對(duì)鮸魚(yú)肝組織中的過(guò)氧化物岐化酶(SOD)起誘

16、導(dǎo)作用導(dǎo)致“毒物興奮效應(yīng)”，高濃度鎘對(duì)鮸魚(yú)、鰱魚(yú)肝組織SOD活力起抑制作用(劉敏海等, 200</p><p>　　近幾年，隨著雙向電泳在蛋白質(zhì)組學(xué)研究領(lǐng)域的普及，已有低溫脅迫大黃魚(yú)(李明云等, 2010)、鎘脅迫牙鲆(黃清育等, 2008)等肝組織蛋白質(zhì)組的分析。受鎘脅迫影響，肝組織的各種蛋白含量有所變化，以期最大程度減少鎘對(duì)機(jī)體的損傷。然而，目前尚無(wú)鎘脅迫對(duì)香魚(yú)肝組織蛋白質(zhì)組的報(bào)道。而將香魚(yú)作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象是研究

17、鎘脅迫對(duì)洄游魚(yú)類(lèi)肝組織蛋白的變化，有助于將香魚(yú)肝組織蛋白質(zhì)作為生物標(biāo)記對(duì)水域環(huán)境污染情況作進(jìn)一步評(píng)估。這項(xiàng)研究結(jié)果有助于分析現(xiàn)場(chǎng)收集的香魚(yú)肝組織，進(jìn)一步分析香魚(yú)在污染水域中的受污染情況，并為水產(chǎn)品中的Cd 污染進(jìn)行深入研究和監(jiān)控提供參考。</p><p>　　現(xiàn)有的生物監(jiān)測(cè)技術(shù)側(cè)重于研究各類(lèi)生物有機(jī)體對(duì)重金屬的富集量和表達(dá)單一蛋白質(zhì)指示物的規(guī)律，而蛋白質(zhì)雙向凝膠電泳有助于更為全面的分析鎘脅迫對(duì)香魚(yú)肝組織蛋白質(zhì)組學(xué)

18、的影響(黃清育等,2008)。在區(qū)分野生鱘魚(yú)、養(yǎng)殖鱘魚(yú)以及腌制鱘魚(yú)(Martinez et al. 2007)，急性鎘脅迫牙鲆鰓組織蛋白的變化及腦組織運(yùn)鐵蛋白含量的變化(Zhu JY et al. 2006; Ling XP, 2009)，中華絨螯蟹急慢性鎘脅迫下前鰓蛋白質(zhì)變化(Silvestre et al. 2006)，鎘脅迫下大黃魚(yú)肝組織中運(yùn)鐵蛋白和鐵調(diào)素基因表達(dá)的變化(Chen J et al. 2008)，以及不同鹽度脅迫下香

19、魚(yú)載脂蛋白含量的變化(Chen J et al. 2009)等方面進(jìn)行過(guò)基于雙向電泳技術(shù)的蛋白質(zhì)組學(xué)研究。</p><p>　　因此，本課題擬將通過(guò)雙向凝膠電泳實(shí)驗(yàn)從蛋白質(zhì)組的角度了解鎘脅迫對(duì)肝組織蛋白質(zhì)的影響，優(yōu)化分離受氯化鎘污染前后香魚(yú)肝蛋白質(zhì)組，構(gòu)建差異蛋白質(zhì)組的電泳圖譜，其技術(shù)可為今后連續(xù)監(jiān)測(cè)流動(dòng)水體中各類(lèi)重金屬污染程度及危害性提供可行性分析技術(shù)。</p><p><b>

20、;　　2 材料和方法</b></p><p><b>　　2.1 實(shí)驗(yàn)材料</b></p><p><b>　　2.1.1 實(shí)驗(yàn)魚(yú)</b></p><p>　　實(shí)驗(yàn)香魚(yú)采自浙江寧波寧海，在實(shí)驗(yàn)室淡水暫養(yǎng)7天以適應(yīng)實(shí)驗(yàn)室養(yǎng)殖環(huán)境，再選取健康活潑的個(gè)體作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象。暫養(yǎng)期間每天早晚?yè)Q水喂食一次，各水箱全天不間斷充氣

21、。每天三次定時(shí)測(cè)定并記錄水溫，使溫度均保持在20±1℃。實(shí)驗(yàn)前24h停止喂食，避免飼料中的重金屬組分產(chǎn)生干擾，影響測(cè)定結(jié)果的可靠性。</p><p>　　2.1.2 試劑與儀器</p><p><b>　　試劑：</b></p><p>　　Bradford 工作液：考藍(lán)G-250：35mg；磷酸：50ml，乙醇25ml加水至500m

22、l</p><p>　　BSA標(biāo)準(zhǔn)蛋白：用牛血清蛋白配置1mg/ml的標(biāo)準(zhǔn)蛋白</p><p>　　蛋白裂解液Ⅰ：7 M 尿素， 2 M 硫脲，4% w/v CHAPS，1% w/v DTT，0.2% v/v載體兩性電解質(zhì)和蛋白酶抑制劑混合物</p><p>　　水化上樣緩沖液：尿素7M，硫脲2M，CHAPS4%，DTT 65mM，Bio-Lyte0.2%(w/v)

23、(現(xiàn)加)，溴酚藍(lán)0.001%，分裝成10小管，每小管1ml，-20℃冰箱保存</p><p>　　1×SDS-PAGE電泳緩沖液：25mM Tris，192mM glycine，0.1% SDS，pH8.3</p><p>　　膠條平衡緩沖液I：尿素6 M，SDS 2%(w/v)，Tris-HCl 0.375 M (pH 8.8)，甘油20%，DTT 2%(w/v) ，充分混勻，

24、現(xiàn)配</p><p>　　膠條平衡緩沖液II：尿素6 M， SDS 2%(w/v)，Tris-HCl 0.375 M (pH 8.8)，甘油20%，碘乙酰胺2.5%(w/v)，充分混勻，用時(shí)現(xiàn)配</p><p>　　30% 聚丙烯酰胺貯液：丙烯酰胺150g，甲叉雙丙烯酰胺4g，加MilliQ水至500ml濾紙過(guò)濾后，棕色瓶4℃冰箱保存</p><p>　　pH8.8

25、的1.5mol/L Tris堿：Tris堿90.75g，加 MilliQ水至400ml用HCl調(diào)pH至8.8，最后加MilliQ水定容至500ml。4℃冰箱保存。</p><p>　　10%SDS：稱(chēng)取SDS10g加MilliQ水至100ml混勻后，室溫保存。</p><p>　　10%APS：稱(chēng)取Ap0.1g加MilliQ水至1ml溶解后，4℃冰箱保存，現(xiàn)用現(xiàn)配</p>

26、<p>　　儀器：等電聚焦儀；垂直電泳系統(tǒng)；掃描儀 GS-800和PDQuest 分析軟件等購(gòu)自 Bio-Rad (美國(guó))</p><p><b>　　2.2 實(shí)驗(yàn)方法</b></p><p>　　2.2.1 染毒分組及取樣</p><p>　　將氯化鎘(CdCl2·5/2H2O)配成Cd2+濃度為5g/L的母液在常溫下保存

27、。用此兌換成急性脅迫組(5mg/L，參考國(guó)家漁業(yè)水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)中所規(guī)定的鎘離子濃度為0.005mg/L，急性脅迫組為標(biāo)準(zhǔn)濃度的1000倍)，設(shè)兩個(gè)重復(fù)組，每組放置14尾香魚(yú)。試驗(yàn)用塑料水箱規(guī)格為60×40×50cm，每個(gè)水箱裝水70L。每天更換相同濃度Cd2+淡水，溫度均保持在20±1℃，pH7.73左右。試驗(yàn)期間每天投喂用水泡過(guò)的市售魚(yú)飼料。</p><p>　　本實(shí)驗(yàn)5mg/L濃度組作

28、為急性鎘脅迫實(shí)驗(yàn)組，暴露24h后取樣。對(duì)香魚(yú)樣品進(jìn)行體長(zhǎng)測(cè)量，平均體長(zhǎng)約21cm，活體解剖香魚(yú)，快速取出實(shí)驗(yàn)所需的肝組織，放在預(yù)先準(zhǔn)備好的做有標(biāo)記的離心管里，并立即將其丟入液氮中。等樣品全部取完后進(jìn)行分組，標(biāo)注后放-70℃冰箱中保存待用。</p><p>　　2.2.2 蛋白質(zhì)樣品的制備</p><p>　　制樣前將臺(tái)面用酒精棉球擦干凈，研缽、濾紙、酒精棉球、液氮、剪刀、鑷子、蛋白裂解液、

29、預(yù)冷的PBS緩沖液等準(zhǔn)備充分。取出保存好的香魚(yú)肝組織3份，在預(yù)冷的PBS中清洗兩遍去除血跡，迅速放進(jìn)液氮預(yù)冷的研缽中進(jìn)行研磨，研磨過(guò)程中不斷加入液氮以防組織反復(fù)凍融直至組織被研磨成粉末狀；用1.5ml的離心管收集稱(chēng)量，樣品粉末可達(dá)到0.2-0.3g。</p><p>　　研磨好的樣本加1：3-5(一般1.5ml)裂解液36℃ 水浴1h；12000g，4℃離心1h，取中間層于新的1.5ml離心管中；15000g，4

30、℃離心1h，取中間層于新的1.5ml離心管中；取10µl用于測(cè)定蛋白濃度，其余分裝后于-70℃保存?zhèn)溆谩?lt;/p><p>　　2.2.3 蛋白質(zhì)雙向電泳</p><p>　　2.2.3.1 蛋白濃度的測(cè)定</p><p>　　蛋白濃度測(cè)定采用Bradford法(1976)，以牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)蛋白，根據(jù)表1，作BSA蛋白濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線。混勻后，室溫下(20℃

31、-25℃)放置3min，于A595下測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)品的吸光值(OD)。</p><p>　　表1 蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線制作</p><p>　　Tab 1 Making of protein standard curve </p><p>　　圖1為以牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)蛋白制作的標(biāo)準(zhǔn)曲線，其中蛋白含量為橫軸，吸光度為縱軸。曲線方程為：y = 0.0476x - 0.0007；R

32、2 =0.9995。</p><p><b>　　圖1 蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線</b></p><p>　　Fig 1 The standard curve of protein</p><p>　　根據(jù)所得曲線測(cè)得所制對(duì)照組樣品濃度為22.01μg/μl，處理組為22.09 μg/μl。每次測(cè)蛋白濃度時(shí)均要同時(shí)做相應(yīng)的蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線。</p>

33、<p>　　2.2.3.2 第一向等電聚焦(IEF)</p><p>　　等電聚焦電泳主要按照Görg 的描述的方法(Görg et al. 2000)，同時(shí)參照Bio-Rad儀器系統(tǒng)操作指南，以及吳海慶等(吳海慶等, 2009)的雙向電泳優(yōu)化方法。首先，從-20℃冰箱中取出IPG干膠條在室溫中平衡10min；根據(jù)上樣量(1mg)取不同體積的制備好的香魚(yú)肝組織蛋白樣品與上樣緩沖液

34、充分混合，均勻加入等電聚焦槽中。撕去IPG干膠條的保護(hù)膜，調(diào)整正負(fù)極，膠面朝下放入，注意膠條下面的溶液不能有氣泡。在膠條上面覆蓋2ml礦物油，防止膠條水化過(guò)程中液體的蒸發(fā)(注：極限電流為30-50uA/根；等電聚焦溫度為恒溫20℃)。</p><p>　　本實(shí)驗(yàn)所用的17cm膠條上樣量為1mg，在通用型17cm聚焦盤(pán)內(nèi)50V主動(dòng)水化12小時(shí)，250V線性除鹽 1h，500V線性除鹽1h，1000V線性升壓1h，8

35、000V線性升壓6h，8000V快速聚焦至88kVh。之后保持電壓在500V至膠條取出。</p><p>　　2.2.3.3 IPG膠條的平衡</p><p>　　平衡過(guò)程將導(dǎo)致蛋白丟失，同時(shí)造成圖譜分辨率降低。但不經(jīng)平衡，蛋白質(zhì)將得不到充分的變性，因而會(huì)影響蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致高分子量蛋白的紋理現(xiàn)象，并且等電聚焦凝膠會(huì)粘在SDS膠上。縮短平衡時(shí)間可以減少擴(kuò)散，但會(huì)減少向第二向的轉(zhuǎn)移。因此，

36、有必要對(duì)IPG膠條進(jìn)行兩步平衡，時(shí)間至少2×10min，不要超過(guò)2×15nim，以免過(guò)度平衡引起蛋白的過(guò)多降解和擴(kuò)散。</p><p>　　聚焦結(jié)束后取出膠條，進(jìn)行IPG膠條的兩次平衡：</p><p>　　(1) 用準(zhǔn)備好濕潤(rùn)濾紙吸去IPG膠條上殘余礦物油及多余樣品(可有效減少縱條紋的產(chǎn)生)；</p><p>　　(2) 將IPG膠條放入水化盤(pán)

37、中，加入2ml的平衡緩沖液Ⅰ，再放置于水平搖床上振蕩15min (打開(kāi)二硫鍵，使蛋白還原更完全)；</p><p>　　(3) 從平衡緩沖液Ⅰ中，將IPG膠條取出移入加有2ml平衡緩沖液Ⅱ水化盤(pán)中，置水平搖床上再振蕩15min。加入的碘乙酰胺可去除多余的DTT(DTT過(guò)多會(huì)導(dǎo)致點(diǎn)拖尾)；</p><p>　　(4) 取出IPG膠條，浸入1×SDS-PAGE電泳緩沖液中漂洗5s，將

38、膠條的邊緣置于濾紙上幾秒，以除去多余的緩沖液。再將膠條移到準(zhǔn)備好的SDS凝膠上。</p><p>　　2.2.3.4 第二向聚丙烯酰胺凝膠垂直電泳(SDS—PAGE) </p><p>　　SDS-PAGE主要是根據(jù)蛋白質(zhì)分子量的大小，在豎直方向上分離各種蛋白質(zhì)。聚丙烯酰胺濃度越大，凝膠孔徑越小，本實(shí)驗(yàn)采用濃度為12%的聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行第二向的垂直凝膠電泳。根據(jù)比例將膠灌制好倒入制膠

39、儀，用水壓面直到膠面與水面被壓出一條很明顯的直線，說(shuō)明膠已凝固。小心傾斜倒去水，用小片濾紙吸取多余水分。</p><p>　　然后進(jìn)行膠條的轉(zhuǎn)移：將IPG膠條小心的轉(zhuǎn)移到置備好的SDS凝膠上，用預(yù)溶的0.5%低熔點(diǎn)瓊脂糖封膠，輕壓IPG膠條支持面，使其與SDS凝膠充分接觸，排除其間小空泡，在4℃冰箱中靜置，直到低熔點(diǎn)瓊脂糖凝固。將膠條正負(fù)極和電泳槽的正負(fù)極相對(duì)應(yīng)，在將凝膠轉(zhuǎn)移到電泳槽中。加入1×SDS-

40、PAGE電泳緩沖液。接通電源，設(shè)定電泳運(yùn)行條件：起始電壓為80V，30min，之后170V，恒溫20℃。當(dāng)溴酚藍(lán)指示劑到達(dá)膠底部邊緣時(shí)，停止電泳(約5h)，拆下玻璃板準(zhǔn)備染色。</p><p>　　2.2.3.5 凝膠染色及脫色</p><p>　　考馬斯亮藍(lán)G-250染色：固定液固定2h，考藍(lán)G-250染液(1%考馬斯亮藍(lán)G-250，40%乙醇，10%乙酸)染色12h，脫色液(40%乙醇

41、 10%乙酸)脫色一天至蛋白點(diǎn)清晰，最后用蒸餾水清洗至背景干凈。 </p><p>　　2.2.4 圖象獲得及分析</p><p>　　采用GS-800掃描儀掃描脫色后的凝膠，并采用PDQuest? 2-D分析軟件(Version 7.4.0, BIO-RAD Healthcare)對(duì)掃描圖譜處理分析。蛋白點(diǎn)檢測(cè)采用對(duì)自動(dòng)檢定的蛋白點(diǎn)加以人工校對(duì)的半自動(dòng)模式。</p>

42、<p>　　2.2.5 蛋白質(zhì)切膠及質(zhì)譜分析</p><p>　　軟件處理分析后，以Total quantity in valid spot(指所有檢測(cè)出的蛋白點(diǎn)的濃度總和)做為標(biāo)準(zhǔn)，選取差異在2倍或2倍以上的蛋白點(diǎn)進(jìn)行標(biāo)記，然后從膠上切取放進(jìn)標(biāo)記好的離心管中，以便送樣分析。 </p><p>　　切割差異蛋白質(zhì)點(diǎn)置于離心管中，送往上海杰眾質(zhì)譜公司進(jìn)行串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS-MS)

43、分析或肽指紋圖譜 (MALDI-TOF-MS) 分析。最后應(yīng)用Mascot 軟件在脊索動(dòng)物蛋白質(zhì)公共數(shù)據(jù)庫(kù)(NCBI、SWISS-PROT)中搜尋，獲得蛋白質(zhì)的相關(guān)信息。</p><p><b>　　3 結(jié)果與討論</b></p><p>　　3.1 對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組差異蛋白點(diǎn)的篩選及比較</p><p>　　經(jīng)PDQuest軟件分析，香魚(yú)肝臟蛋

44、白點(diǎn)主要集中在20-100 kDa。每塊凝膠的蛋白點(diǎn)約540個(gè)，圖譜蛋白質(zhì)點(diǎn)匹配率達(dá)90 %以上，表明圖譜可作進(jìn)一步分析研究。經(jīng)對(duì)比，共有27個(gè)蛋白點(diǎn)在鹽度脅迫后表達(dá)量發(fā)生明顯變化(見(jiàn)圖2、圖3)。與對(duì)照組相比，Cd脅迫組肝中1-11，27號(hào)蛋白表達(dá)量上調(diào)，其余表達(dá)量下調(diào)。27個(gè)蛋白點(diǎn)中有23個(gè)點(diǎn)得到成功分析，通過(guò)Mascot軟件在數(shù)據(jù)庫(kù)中搜索得到的蛋白信息見(jiàn)表2。</p><p>　　圖 2 處理組香魚(yú)肝臟蛋白

45、質(zhì)組雙向電泳圖譜(a)</p><p>　　Fig. 2 Two dimensional electrophoretic gel of Liver Proteome in Cd-treated ayu (a)</p><p>　　圖 3 對(duì)照組香魚(yú)肝臟蛋白質(zhì)組雙向電泳圖譜(b)</p><p>　　Fig. 3 Two dimensional electrophor

46、etic gel of Liver Proteome in healthy control Ayu (b)</p><p>　　表 2 急性鎘脅迫香魚(yú)肝臟差異蛋白點(diǎn)表達(dá)</p><p>　　Tab. 2 Proteins differences in liver of ayu exposed to acute Cd</p><p>　　a 蛋白點(diǎn)順序號(hào)，切取的點(diǎn)與圖

47、3點(diǎn)相對(duì)應(yīng)，蛋白點(diǎn)差異值為兩倍及兩倍以上，所有數(shù)值符合單項(xiàng)檢驗(yàn)方差 (P < 0.05)</p><p>　　b 倍數(shù)，表示為鎘脅迫組和對(duì)照組的膠上相對(duì)應(yīng)蛋白的光密度比值(與對(duì)照組相比)</p><p>　　3.2 Cd脅迫條件下表達(dá)量上調(diào)的蛋白質(zhì)</p><p>　　苯丙氨酸-4-羥化酶(Phenylalanine-4-hydroxylases )(點(diǎn)1,

48、2)是苯丙氨酸代謝中的限速酶。酸性核糖體蛋白P0(60S acidic ribosomal protein P0, RPLP0)(點(diǎn)3)是位于真核生物核糖體60S大亞基上的三種核糖體磷酸化蛋白(RPLP0，RPLP1，RPLP2)中的一種，通過(guò)維持核糖體穩(wěn)定性和活性以及與延伸因子作用參與蛋白合成延伸階段的調(diào)節(jié)來(lái)參與蛋白質(zhì)合成的調(diào)節(jié)。蘋(píng)果酸脫氫酶(Malate dehydrogenase, MDH)(點(diǎn)4)利用NAD +在蘋(píng)果酸向草酰乙酸

49、轉(zhuǎn)變的可逆氧化反應(yīng)中起催化作用。醛脫氫酶(Aldehyde dehydrogenases, ALDHs)(點(diǎn)5, 11)在脂質(zhì)過(guò)氧化生成醛類(lèi)的解毒方面發(fā)揮重要作用。熱休克蛋白70 (Heat shock protein 70, HSP70)(點(diǎn)6)作為分子伴侶，具有高度保守性，是一種普遍存在的應(yīng)激反應(yīng)表達(dá)蛋白。碳酸酐酶(Carbonic anhydrases)(點(diǎn)7, 9)是一種鋅金屬酶，能夠催化二氧化碳的可逆水合反應(yīng)。胰蛋白酶原(Tr

50、ypsinogen, TRY</p><p>　　3.3 Cd脅迫條件下表達(dá)量下調(diào)的蛋白質(zhì)</p><p>　　糖磷酸變位酶(Phosphoglucomutas, PGM)(點(diǎn)13)催化葡萄糖-1-磷酸向葡萄糖-6-磷酸轉(zhuǎn)換。角蛋白(Keratin)(點(diǎn)14)是一種雜肽蛋白，是中間纖維骨架的組成成分。2-氧異纈氨酰化脫氫酶(2-oxoisovalerate dehydrogenase)(點(diǎn)

51、15)在亮氨酸、異亮氨酸和纈氨酸等支鏈氨基酸分解代謝的第二個(gè)主要步驟起催化作用。載脂蛋白AI (Apolipoprotein A-I , Apo-AI)(點(diǎn)16)是血清中高密度脂蛋白的主要組成部分，參與從組織分泌到肝臟膽固醇的逆向運(yùn)輸。甜菜堿高半胱氨酸S-甲基轉(zhuǎn)移酶(BHMT)(點(diǎn)17)是一種胞液酶，催化將N-甲基組從甜菜堿轉(zhuǎn)移到高半胱氨酸，分別得到二甲基甘氨酸和甲硫氨酸產(chǎn)物。2-氧代-4-羥基-4-羧基-5-脲基咪唑啉脫羧酶(2-ox

52、o-4-hydroxy-4-carboxy-5-ureido imidazoline decarboxylase, UraD)(點(diǎn)18)催化尿酸的氧化降解，產(chǎn)物為(S)-尿囊素，這是嘌呤代謝的后期階段。3-羥氨苯甲酸-3,4-加氧酶(3-hydroxyanthranilate 3</p><p><b>　　3.4 討論</b></p><p>　　魚(yú)組織和體液的蛋白

53、組成和含量的變化都與生理生活環(huán)境密切相關(guān)(Ky et al. 2007)。本實(shí)驗(yàn)采用蛋白質(zhì)組學(xué)方法監(jiān)測(cè)香魚(yú)肝臟蛋白質(zhì)組，研究Cd脅迫對(duì)香魚(yú)肝組織相關(guān)蛋白表達(dá)量的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明相關(guān)蛋白主要涉及到鎘誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激、甲基代謝、金屬代謝和核酸代謝等。</p><p>　　3.4.1 氧化應(yīng)激</p><p>　　在香魚(yú)肝急性Cd誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激反應(yīng)中，HSP70，GST和ALDH表達(dá)量上調(diào)。根據(jù)

54、應(yīng)激反應(yīng)與魚(yú)類(lèi)生理狀態(tài)的密切相關(guān)，可以定量測(cè)定某一生物所受到的環(huán)境脅迫強(qiáng)度。</p><p>　　HSP70是魚(yú)類(lèi)中研究最廣泛且含量最為豐富的一類(lèi)熱休克蛋白，作為分子伴侶協(xié)助新生多肽鏈的折疊，蛋白質(zhì)復(fù)合體的裝配，以及調(diào)節(jié)、修復(fù)和降解變性的蛋白質(zhì)方面起著重要作用(祝璟琳等, 2007)。HSP70已經(jīng)在生物監(jiān)測(cè)和環(huán)境毒理學(xué)中得到廣泛的應(yīng)用(Mukhopadhyay et al. 2003)，沈驊等探討了HSP70

55、作為重金屬污染條件下生物標(biāo)記物的潛力(沈驊等, 2004)。有研究早已表明，Cd脅迫能夠引起HSP70表達(dá)量的上調(diào)(Salminen et al. 1996)。已經(jīng)證實(shí)在Cd脅迫魚(yú)類(lèi)中HSP70的存在(Ling XP et al. 2009; Williams et al. 2006)。Ali 等發(fā)現(xiàn)在正常鯉魚(yú)的肌肉和腦組織中不能檢測(cè)出HSP70 mRNA 的表達(dá)，其肝、腎組織中的表達(dá)很有限，但用高溫、Cd對(duì)普通鯉魚(yú)進(jìn)行體內(nèi)脅迫后，其表

56、達(dá)明顯升高，與時(shí)間和濃度呈正相關(guān)(Ali et al.2003)。在那宏坤等人鎘脅迫實(shí)驗(yàn)中，CdCl 2 (10mg /L)污染的環(huán)境中連續(xù)飼養(yǎng) 72 h的牙鲆肝臟中發(fā)現(xiàn)，HSP70含量上調(diào)(那宏坤等, 2009)。高濃度、時(shí)間長(zhǎng)的Cd脅迫實(shí)</p><p>　　GSTs對(duì)環(huán)境污染物有一定的解毒功能。研究發(fā)現(xiàn)，Cd脅迫能夠促進(jìn)小鼠肝細(xì)胞、栗酒裂殖酵母(Bae et al. 2004)、中華絨螯蟹(Silvestr

57、e et al. 2006)、暗紋東方豚(Kim et al. 2010)、香魚(yú)(本實(shí)驗(yàn))中GSTs表達(dá)的活性(Casalino et al. 2004)。在急性Cd處理的香魚(yú)肝中GST表達(dá)量上調(diào)與河豚相一致(Kim et al. 2010)。</p><p>　　ALDH是另外一種催化脂源性醛解毒的酶，目的是為了減少其對(duì)生物體的潛在危害。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)在某些環(huán)境脅迫下，魚(yú)類(lèi)ALDH表達(dá)量會(huì)上調(diào)，包括低溫(Ibarz

58、et al. 2010)、環(huán)境污染物(Williams et al. 2003)和滲透脅迫(Chen J et al. 2009)。本實(shí)驗(yàn)急性Cd脅迫引起ALDH表達(dá)量的上調(diào)，可能是抗氧化過(guò)程中對(duì)GST路徑的補(bǔ)充。</p><p>　　3.4.2 甲基代謝</p><p>　　MAT和BHMT，是肝甲基化循環(huán)中的兩種代謝酶，在本研究中的香魚(yú)急性Cd脅迫實(shí)驗(yàn)組中表達(dá)下調(diào)。MAT是在甲基化循環(huán)

59、中通過(guò)消耗甲基形成腺苷甲硫氨酸(AdoMet)的必須酶。BHMT是唯一已知的利用甜菜堿作為底物介導(dǎo)甲基化作用的酶(Pajares et al. 2006)。甜菜堿是魚(yú)類(lèi)體內(nèi)一個(gè)重要的合成甲硫氨酸的甲基供體(Simon et al. 1999)。MAT和BHMT表達(dá)量的下調(diào)可能反應(yīng)了肝臟中AdoMet的含量的下降。在急性Cd脅迫誘導(dǎo)氧化應(yīng)激的過(guò)程中，DNA的甲基化是一個(gè)重要的過(guò)程(Takiguchi et al. 2003; Huang

60、D et al. 2008)。DNA甲基轉(zhuǎn)移酶的反應(yīng)機(jī)理包括直接從AdoMet到DNA甲基化的甲基轉(zhuǎn)移過(guò)程(Aranda et al. 2010)。研究發(fā)現(xiàn)，急性Cd脅迫處理后的香魚(yú)肝中MAT和BHMT表達(dá)量的下調(diào)可能是由于AdoMet含量的降低導(dǎo)致的DNA甲基化過(guò)程的紊亂。</p><p>　　3.4.3 核酸代謝</p><p>　　本研究中，我們首次發(fā)現(xiàn)Cd脅迫香魚(yú)肝中的UraD表達(dá)

61、量上調(diào)。由于嘌呤代謝包含UraD，UraD的表達(dá)紊亂現(xiàn)象較為合理。在嘌呤分解代謝中，尿酸作為一鍵化合物降解為(S)-尿囊素，由UraD催化產(chǎn)生(Cendron et al. 2007)。因此，UraD表達(dá)量的下調(diào)部分反應(yīng)了嘌呤代謝的紊亂，由此可以解釋Cd脅迫對(duì)DNA的破壞。</p><p>　　在本實(shí)驗(yàn)中，急性Cd脅迫導(dǎo)致香魚(yú)肝生理過(guò)程中蛋白的選擇性表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)首次發(fā)現(xiàn)Cd毒性對(duì)BHMT和UraD兩種蛋白表達(dá)量

62、的改變，這在一定程度上反應(yīng)了DNA甲基化和嘌呤代謝的紊亂。某些蛋白表達(dá)水平的變化可作為水環(huán)境Cd的魚(yú)類(lèi)生物標(biāo)志物。</p><p>　　3.4.4 金屬代謝</p><p>　　對(duì)于組織來(lái)說(shuō)，Cd脅迫造成的另外一個(gè)效果是干擾金屬離子的功能和新陳代謝，如Fe、Zn。已發(fā)現(xiàn)相關(guān)魚(yú)類(lèi)經(jīng)Cd脅迫實(shí)驗(yàn)后，Tf 表達(dá)量會(huì)下調(diào)(Chen J et al. 2008; Zhu JY et al. 2006

63、)。本研究急性Cd脅迫的香魚(yú)肝組織的Tf表達(dá)量下降，與目前相關(guān)調(diào)查研究相符。由于Cd與Zn很多相似處，所以Cd在生物系統(tǒng)中可以替換Zn。</p><p>　　碳酸酐酶是一種鋅金屬酶，在呼吸作用和酸堿平衡中扮演重要角色，電解質(zhì)分泌，骨吸收，鈣化及生物合成等反應(yīng)中需要HCO3?作為基質(zhì)(Henry, 1996)。眾所周知，在不同的生物體中，重金屬會(huì)影響碳酸酐酶的活性和表達(dá)(Soyut et al. 2008; Rob

64、erto et al. 2010)。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，急性Cd會(huì)導(dǎo)致碳酸酐酶在香魚(yú)肝臟中的表達(dá)量上調(diào)。</p><p>　　3.4.5 其他代謝</p><p>　　根據(jù)蛋白質(zhì)組學(xué)分析，在Cd脅迫處理組和對(duì)照組的肝，總共鑒定出20種差異表達(dá)的蛋白。以上列舉的8種蛋白的選擇性表達(dá)與應(yīng)對(duì)急性Cd脅迫的特殊反應(yīng)相關(guān)，本研究反應(yīng)并補(bǔ)充了Cd脅迫的制毒機(jī)理。</p><p>　　另

65、外12種蛋白，其他表達(dá)變化的蛋白質(zhì)需要進(jìn)一步研究它們?cè)诩毙訡d脅迫的生理意義。這些蛋白參與各種生理過(guò)程，包括葡萄糖代謝 (MDH 和PGM)，氨基酸和蛋白質(zhì)代謝(苯丙氨酸-4-羥化酶, RPLP0, TRY, 2-氧異纈氨酰化脫氫酶和HAD)、脂質(zhì)代謝(Apo-AI和酯水解酶)、呼吸鏈 (CCR)、細(xì)胞分化(NDRG1)和細(xì)胞骨架 (角蛋白)。</p><p><b>　　4 小結(jié)</b>&

66、lt;/p><p>　　總的說(shuō)來(lái)，香魚(yú)肝臟中蛋白質(zhì)的表達(dá)量的不同反應(yīng)了香魚(yú)在Cd污染環(huán)境下體內(nèi)的解毒反應(yīng)。這些蛋白質(zhì)直接或間接的降低Cd污染對(duì)生理機(jī)制的破壞的解毒過(guò)程中起到了重要作用。在急性鎘脅迫下，如果Cd污染水質(zhì)對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生的損傷不能被及時(shí)修復(fù)，香魚(yú)體內(nèi)環(huán)境的動(dòng)態(tài)平衡就會(huì)被打破，當(dāng)這種變化超過(guò)調(diào)節(jié)能力，就會(huì)引起香魚(yú)的各種生理反應(yīng)，甚至死亡。</p><p>　　因河流及河口是重金屬污染物的主

67、要承載者，有毒重金屬均能使各種魚(yú)類(lèi)產(chǎn)生中毒癥狀，人們普遍認(rèn)為魚(yú)類(lèi)是水環(huán)境重金屬污染監(jiān)測(cè)的重要模式生物。相關(guān)研究已有詳細(xì)報(bào)道，并發(fā)現(xiàn)了一些適合于檢測(cè)流動(dòng)海淡水中重金屬污染程度的標(biāo)記蛋白質(zhì)(劉敏海等, 2007; 呂景才等, 2002)及耳石(Ranaldi et al, 2009)。由于香魚(yú)生命周期跨越河流、咸淡水和海水，因此香魚(yú)是可考慮的研究水生生物受重金屬脅迫反應(yīng)的魚(yú)類(lèi)模式生物。</p><p>　　蛋白質(zhì)作為

68、生物機(jī)體物質(zhì)基礎(chǔ)和生命活動(dòng)的執(zhí)行者，當(dāng)外界環(huán)境發(fā)生改變時(shí)，機(jī)體細(xì)胞基因組轉(zhuǎn)錄和 RNA 干擾水平也會(huì)隨之改變，而最終影響到細(xì)胞蛋白質(zhì)的表達(dá)(馮德芹等, 2006)。在受鎘污染后，香魚(yú)肝臟組織有27個(gè)差異蛋白質(zhì)斑點(diǎn)，并有質(zhì)和量的變化趨勢(shì)，這種趨勢(shì)有望以整體差異蛋白質(zhì)組作為檢測(cè)流動(dòng)水體中鎘污染程度的指示物，但還需進(jìn)一步研究。與目前采用的單一的差異蛋白質(zhì)或其他物質(zhì)作為標(biāo)志物更為可靠。可進(jìn)一步結(jié)合生產(chǎn)實(shí)踐為漁業(yè)生產(chǎn)和環(huán)境監(jiān)測(cè)制定指導(dǎo)建議。<

69、;/p><p>　　完善的蛋白質(zhì)標(biāo)志物組和獲取具有高度重復(fù)性的雙向凝膠電泳圖譜將有助于為今后實(shí)施蛋白質(zhì)組圖譜標(biāo)準(zhǔn)化提供可行性技術(shù)，只要獲取蛋白質(zhì)雙向凝膠電泳標(biāo)準(zhǔn)圖譜就可直接評(píng)價(jià)流動(dòng)水體中各類(lèi)污染源的污染程度及其對(duì)海洋動(dòng)物的危害性，簡(jiǎn)化現(xiàn)有蛋白技術(shù)監(jiān)測(cè)流動(dòng)水體污染程度時(shí)所需的復(fù)雜分析步驟等。</p><p><b>　　參考文獻(xiàn)</b></p><p&g

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