基于蛋白組學(xué)和同位素分餾對(duì)小球藻吸收氨氮機(jī)制的研究.pdf

1、作為水環(huán)境中最常見(jiàn)的污染物，氨氮易引起富營(yíng)養(yǎng)化現(xiàn)象等一系列環(huán)境問(wèn)題的發(fā)生，我國(guó)“十二五”期間已經(jīng)明確提出氨氮減排10％的目標(biāo)。藻類具有生長(zhǎng)迅速以及高效去除氨氮的能力，并且在消減氨氮的同時(shí)，可作為魚(yú)類等水生生物的餌料以及再生能源的制備。因此，開(kāi)發(fā)基于藻類的生物技術(shù)消減氨氮，是污水廠實(shí)現(xiàn)氨氮達(dá)標(biāo)排放、減輕氨氮對(duì)水體自然生態(tài)環(huán)境危害程度的現(xiàn)實(shí)需要，也為氨氮轉(zhuǎn)化為有價(jià)值的生物資源提供理論和技術(shù)支持。
　　利用氨氮作為唯一氮源的微生物能夠區(qū)

2、分15N和14N，這種選擇性分餾為胞外不同氨氮水平在生物體內(nèi)吸收轉(zhuǎn)化提供重要證據(jù)，而蛋白組學(xué)技術(shù)可揭示此吸收過(guò)程中參與氨氮代謝相關(guān)蛋白的差異。研究表明，藻類對(duì)氨氮的去除主要是通過(guò)氨氮的吸收，然而與氨氮吸收代謝相關(guān)的氮同位素效應(yīng)，特別是不同氨氮濃度水平對(duì)藻類吸收氨氮的影響機(jī)制，包括藻體中氨氮的分餾效應(yīng)和參與氨氮代謝的相關(guān)基因和酶，到目前還沒(méi)有充分揭示。為此，本文以小球藻（Chlorella vulgaris）為代表，以氨氮為唯一氮源，利用

3、15N分餾機(jī)制和蛋白組學(xué)研究了不同氨氮濃度水平對(duì)藻類吸收氨氮的差異，以及在此過(guò)程中參與氨氮代謝的相關(guān)基因和酶類，并探索了藻類對(duì)氨氮的吸收機(jī)制。論文獲得了以下研究結(jié)論：
　?。?）在4-50 mg/L初始氨氮濃度條件下，小球藻生長(zhǎng)速率呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，且在10 mg/L時(shí)達(dá)到最大（4.86×105 cells/(mL?d)）。小球藻對(duì)氨氮的去除效率隨初始氨氮濃度的升高而降低，實(shí)驗(yàn)六天后氨氮的去除率由100％降至0.4％。小球藻

4、對(duì)氨氮的吸收速率隨著初始氨氮濃度的升高呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢(shì)，且在10 mg/L時(shí)達(dá)到最大（2.05×10-10 mg/(cell?d)）。因此，在10 mg/L氨氮濃度條件下，小球藻具有最大的生長(zhǎng)速率以及氨氮吸收速率。葉綠素含量隨著氨氮濃度的升高也呈現(xiàn)相同的趨勢(shì)，且在10 mg/L時(shí)葉綠素a（6.49 mg/L）和葉綠素b（6.31 mg/L）均達(dá)到最大。通過(guò)不同氨氮濃度和碳源濃度共同作用對(duì)小球藻生長(zhǎng)、氨氮吸收量和碳源吸收量的影響表明

5、，隨著碳源濃度的升高，小球藻生物量整體呈上升趨勢(shì)，且在40 mg/L時(shí)達(dá)最大（12.21×105 cells/(mL?d)）。且相同氨氮濃度下，碳源濃度高于20 mg/L時(shí)氨氮去除率均可達(dá)100％，對(duì)碳源的吸收量整體呈上升趨勢(shì)，在40 mg/L達(dá)到最大（3.94 mg）。
　　（2）藻細(xì)胞內(nèi)氮同位素分餾程度取決于環(huán)境中氨氮的濃度。在10 mg/L氨氮濃度條件下，培養(yǎng)液和藻細(xì)胞的15N的豐度分別為-3.61±0.06‰和-1.99±

6、0.05‰，富集系數(shù)為-1.63±0.06‰。而在4 mg/L氨氮濃度條件下，其培養(yǎng)液和藻細(xì)胞的15N的豐度分別為-3.50±0.08‰和-1.13±0.06‰，富集系數(shù)為-2.37±0.08‰。說(shuō)明10 mg/L氨氮條件下，小球藻對(duì)氨氮具有更明顯的分餾效應(yīng)。此外通過(guò)生物轉(zhuǎn)化率的比較發(fā)現(xiàn)，在10 mg/L氨氮濃度條件下小球藻對(duì)氨氮的轉(zhuǎn)化率（47.4％）明顯高于4 mg/L（7.0％），也即外部的氨氮轉(zhuǎn)化為細(xì)胞內(nèi)含氮化合物或生物量的程度更

7、顯著。
　　（3）蛋白組學(xué)研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，小球藻在10 mg/L氨氮條件相對(duì)4 mg/L氨氮有162個(gè)蛋白斑點(diǎn)表現(xiàn)出不同程度的上調(diào)和下調(diào)，其中有92個(gè)斑點(diǎn)具有顯著性的差異表達(dá)（n≥3，p<0.05）。通過(guò)飛行時(shí)間質(zhì)譜鑒定出有31個(gè)蛋白分別參與了光合作用、糖代謝、三羧酸（TCA）循環(huán)、氨基酸代謝和蛋白質(zhì)合成等等。其中氨基酸代謝是與氮代謝直接相關(guān)的代謝過(guò)程，尤其是谷氨酸代謝是其余氨基酸代謝以及TCA循環(huán)等的中間代謝過(guò)程。谷氨酰胺合成酶（