七鰓鰻進(jìn)食前后口腔腺比較蛋白質(zhì)組學(xué)研究.pdf

1、七鰓鰻是現(xiàn)存的最原始的無頜類脊椎動(dòng)物，營半寄生生活。成年七鰓鰻可通過其頭部的吸盤結(jié)構(gòu)來吸食大型魚類的血肉，因此又被稱為水中“吸血鬼”。多年的研究發(fā)現(xiàn)，七鰓鰻的口腔腺分泌液lamphredin在其進(jìn)食過程中扮演著非常重要的角色。盡管前期研究發(fā)現(xiàn)lamphredin中含有多種生物活性調(diào)節(jié)劑，例如:抗凝血?jiǎng)?、離子通道阻斷劑和免疫抑制因子等，但是仍有許多未知的低豐度蛋白尚未被鑒定。同時(shí)，這些低豐度蛋白質(zhì)的生物學(xué)功能也未知。此外，前期關(guān)于七鰓鰻口

2、腔腺蛋白質(zhì)特性及功能的研究多來源于生殖洄游期的七鰓鰻。由于該時(shí)期七鰓鰻不再進(jìn)食，因此前期的研究也未能實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)的反映不同進(jìn)食階段七鰓鰻口腔腺內(nèi)全部蛋白質(zhì)的表達(dá)等情況。
　　為了深入闡明七鰓鰻口腔腺內(nèi)蛋白質(zhì)組分與其進(jìn)食習(xí)性的關(guān)系，本研究首次采用分辨率較高的NanoLC-MS/MS質(zhì)譜儀并結(jié)合七鰓鰻Ensembl和NCBI兩個(gè)數(shù)據(jù)庫對(duì)不同進(jìn)食階段的中國東北七鰓鰻（Lampetra morii）口腔腺分泌液進(jìn)行比較蛋白質(zhì)組學(xué)研究。研究發(fā)現(xiàn)

3、七鰓鰻的進(jìn)食習(xí)性與其口腔腺分泌液蛋白質(zhì)的數(shù)量和種類密切相關(guān)。統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果表明:第一，七鰓鰻進(jìn)食60 min后其口腔腺內(nèi)鑒定出的多肽或蛋白數(shù)量顯著增加，為未進(jìn)食組的10倍以上;第二，在七鰓鰻進(jìn)食階段，其口腔腺內(nèi)蛋白質(zhì)的分子質(zhì)量分布更為廣泛，且隨著進(jìn)食時(shí)間的延長，更多大分子蛋白和小分子多肽陸續(xù)出現(xiàn);第三，GO分析結(jié)果表明七鰓鰻進(jìn)食后，其口腔腺可分泌多種與生物學(xué)過程、分子功能和細(xì)胞組成等密切相關(guān)的蛋白質(zhì)以幫助七鰓鰻阻斷進(jìn)食過程中所遇到的多種不

4、利反應(yīng);最后，功能預(yù)測(cè)結(jié)果表明七鰓鰻進(jìn)食后，其口腔腺內(nèi)能夠分泌多種功蛋白來阻斷宿主的凝血、傷害感受、氧化應(yīng)激和免疫反應(yīng)等。在數(shù)億年的進(jìn)化過程中，這些功能蛋白質(zhì)的出現(xiàn)為七鰓鰻獨(dú)特的營半寄生生活方式奠定了基礎(chǔ)。
　　此外，本研究利用質(zhì)譜在七鰓鰻進(jìn)食60 min后的口腔腺分泌液中鑒定出了半胱氨酸蛋白酶抑制劑F。近年來研究結(jié)果顯示來自蛇毒、蚊蟲唾液腺等的半胱氨酸蛋白酶抑制劑在抗菌和抗腫瘤等方面發(fā)揮了重要的作用。因此本研究也采用分子克隆的手

5、段從七鰓鰻口腔腺中克隆出了半胱氨酸蛋白酶抑制劑F(Lampetra morii cystatinF，Lm-CSTF)，并對(duì)其進(jìn)行了生物信息學(xué)分析。由于Lm-CSTF的cDNA序列中含有稀有密碼子，因此本研究在不改變其編碼氨基酸序列的前提下對(duì)Lm-CSTF的cDNA序列進(jìn)行了優(yōu)化，并將其連接至pColdⅠ原核表達(dá)載體，構(gòu)建pColdⅠ-Lm-CSTF表達(dá)質(zhì)粒，并將其轉(zhuǎn)化至E.coli Chaperone Competent BL21中。結(jié)

6、果表明Lm-CSTF以可溶性蛋白質(zhì)的形式大量表達(dá)，這為今后進(jìn)一步研究其生物學(xué)功能奠定了理論和物質(zhì)基礎(chǔ)。
　　綜上，本研究采用比較蛋白質(zhì)組學(xué)方法對(duì)不同進(jìn)食階段七鰓鰻口腔腺分泌液的蛋白質(zhì)組分進(jìn)行了系統(tǒng)及動(dòng)態(tài)的分析。這不僅有助于我們深入闡明七鰓鰻獨(dú)特的進(jìn)食機(jī)制，還為今后探索新型的七鰓鰻口腔腺功能蛋白提供了線索。除此之外，本研究還為保護(hù)和開發(fā)七鰓鰻口腔腺內(nèi)藥用相關(guān)的基因資源，研制具有我國自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的新型藥物以及推動(dòng)我國海洋生物的發(fā)展奠定