急性重度缺氧致大鼠腦組織損傷效應(yīng)及其早期適應(yīng)的蛋白質(zhì)組學(xué)研究.pdf

1、目的和意義：恐怖主義襲擊、自然災(zāi)害和人為劣質(zhì)工程將會(huì)造成各類地面建筑物及地下工程設(shè)施的坍塌,被埋壓廢墟內(nèi)人員常因缺氧窒息和/或復(fù)合創(chuàng)傷而死或預(yù)后不良。同時(shí),臨床上與缺氧相關(guān)的疾病也呈增多趨勢(shì)。在機(jī)體所有器官中,腦對(duì)氧濃度的變化最為敏感,即使在遭受相同程度、相同時(shí)間的缺氧應(yīng)激后,腦組織的損傷也最為嚴(yán)重,且當(dāng)損傷到一定程度時(shí)則難以逆轉(zhuǎn),在治療上尚缺乏特效的手段。迄今有關(guān)常壓缺氧條件下,機(jī)體應(yīng)激所造成的腦損傷效應(yīng)及其機(jī)制和防治等相關(guān)性研究甚為

2、鮮見(jiàn)。本研究旨在通過(guò)系統(tǒng)探討機(jī)體于常壓缺氧應(yīng)激狀態(tài)下,腦組織的生理、病理變化。從整體水平研究機(jī)體對(duì)不同程度缺氧的耐受性;從組織、細(xì)胞和超微結(jié)構(gòu)水平研究腦組織缺氧性改變的特點(diǎn)、程度和規(guī)律,并從組織、細(xì)胞和超微結(jié)構(gòu)水平研究不同腦區(qū)組織對(duì)缺氧適應(yīng)的改變;從分子水平利用蛋白質(zhì)組學(xué)的研究方法,探討腦組織于缺氧早期適應(yīng)過(guò)程中相關(guān)蛋白質(zhì)的表達(dá)變化,并對(duì)缺氧后腦早期適應(yīng)的分子機(jī)制進(jìn)行初步探討。
　　本課題對(duì)缺氧性腦組織損傷及損傷后修復(fù)機(jī)制的研究,

3、將為各類常壓狀下缺氧性腦損傷選擇合適的干預(yù)措施,減輕腦損傷后遺癥提供依據(jù),同時(shí)對(duì)臨床醫(yī)學(xué)(如缺氧性腦病)、航空航天醫(yī)學(xué)、高原醫(yī)學(xué)、海洋醫(yī)學(xué)、運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)等也具有一定的參考意義。
　　材料與方法：(1)采用電子控制設(shè)備、制氮設(shè)備和鋼化玻璃等新型材料獨(dú)立設(shè)計(jì)建立常壓低氧生物醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)艙,用氮?dú)鈱⑴搩?nèi)自然成份的空氣排出,人為地降低艙內(nèi)氧的百分含量,造成常壓低氧環(huán)境;(2)用Wistar大鼠220只,雌、雄各半,在3-10％氧濃度環(huán)境中進(jìn)行缺氧

4、耐受性實(shí)驗(yàn),并對(duì)其動(dòng)脈血行血氧分析;(3)利用光鏡、特殊染色和電鏡對(duì)7％氧濃度環(huán)境中不同持續(xù)時(shí)間(1d、3d、5d、7d、10d、14d)的120只大鼠,雌、雄各半腦組織進(jìn)行病理學(xué)動(dòng)態(tài)觀察,并利用細(xì)胞計(jì)數(shù)和病理圖像分析系統(tǒng)分析缺氧變性細(xì)胞發(fā)生率的變化;(4)通過(guò)基于2DE、質(zhì)譜鑒定、生物信息學(xué)分析的比較蛋白質(zhì)組學(xué)方法研究持續(xù)缺氧7d和14d大鼠大腦前回蛋白質(zhì)表達(dá)譜的變化,探討缺氧對(duì)腦組織損傷的規(guī)律和機(jī)制。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果：(1)自行

5、建成的大型生物醫(yī)學(xué)低氧實(shí)驗(yàn)艙,氧濃度可調(diào)范圍2％～20％,經(jīng)驗(yàn)證、鑒定,該系統(tǒng)在環(huán)境溫度低于28℃時(shí),可連續(xù)穩(wěn)定工作504h。艙內(nèi)氧濃度測(cè)定值與設(shè)定值無(wú)顯著差異,已在12項(xiàng)課題的比格犬、恒河猴、大鼠、小鼠、家兔、C57轉(zhuǎn)基因小鼠進(jìn)行缺氧性實(shí)驗(yàn)中應(yīng)用,性能穩(wěn)定、可靠;(2)大鼠在3％-6％氧濃度環(huán)境中臨床經(jīng)歷痙攣期、昏迷期和瀕死期,1w內(nèi)的死亡率為100％。氧濃度在3％-4％時(shí),雌性大鼠平均耐受時(shí)間分別為17.80±4.18min、17.

6、60±4.12min;雄大鼠的平均耐受時(shí)間分別為7.00±5.35min、16.80±3.85min。5％～6％時(shí),雌性大鼠平均耐受時(shí)間分別為1276.00±986.83min、1524.0±915.26min;雄性大鼠平均耐受時(shí)間分別為122.00±51.06min、655.00±414.25min。7％氧濃度時(shí),僅有雄性大鼠死亡,死亡率為30％,其余動(dòng)物經(jīng)歷代償期和適應(yīng)期。8％～10％氧濃度中1w內(nèi)大鼠無(wú)死亡。雌性大鼠對(duì)缺氧耐受的時(shí)

7、間比雄性顯著延長(zhǎng);(3)7％氧濃度環(huán)境中,大鼠不同腦區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞及膠質(zhì)細(xì)胞均隨缺氧持續(xù)時(shí)間延長(zhǎng)發(fā)生逐漸加重的缺氧性改變。光鏡表現(xiàn)為神經(jīng)元縮小、胞漿嗜酸性增強(qiáng),尼氏體減少,胞核濃縮,形態(tài)不整;部分膠質(zhì)細(xì)胞變性、凋亡。電鏡表現(xiàn)為細(xì)胞形態(tài)不整,胞膜部分溶解,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張、脫顆粒,線粒體腫脹,嵴斷裂、溶解,均質(zhì)化甚至空泡化。胞內(nèi)出現(xiàn)溶酶體較多。核膜部分溶解,染色質(zhì)邊集,核仁消失。微血管內(nèi)皮細(xì)胞、周細(xì)胞輕度變性。上述變化于缺氧持續(xù)7d時(shí)達(dá)到高峰。當(dāng)

8、持續(xù)缺氧10d時(shí),上述損傷減輕,持續(xù)缺氧14d時(shí),損傷組織明顯減輕甚至部分恢復(fù)。圖像分析結(jié)果表明,持續(xù)缺氧1d～7d時(shí),變性細(xì)胞數(shù)進(jìn)行性增加,尼氏染色光密度進(jìn)行性減弱,于持續(xù)缺氧10d～14d時(shí),變性細(xì)胞數(shù)進(jìn)行性減少,尼氏染色光密度進(jìn)行性增強(qiáng)。其中,雄性大鼠神經(jīng)元及膠質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行性變性速度快于雌性,但其恢復(fù)也快于雌性;(4)血?dú)夥治鼋Y(jié)果顯示,缺氧過(guò)程中,動(dòng)脈血pO2、pCO2、pH值和Ca2+濃度下降。持續(xù)缺氧1d～7d時(shí),雄性動(dòng)脈血上述

9、指標(biāo)進(jìn)行性下降,且下降幅度大于雌性。于持續(xù)缺氧10d～14d時(shí),pH值又呈進(jìn)行性上升趨勢(shì)。動(dòng)脈血Ca2+濃度從持續(xù)缺氧1d～10d時(shí)顯著低于對(duì)照組(p<0.05,p<0.01),于持續(xù)缺氧14d時(shí),雌性動(dòng)脈血Ca2+濃度已接近對(duì)照組;(5)持續(xù)缺氧7d時(shí),雌、雄各有173和139個(gè)差異蛋白點(diǎn),14d時(shí),雌、雄各有151和89個(gè)差異蛋白點(diǎn)。經(jīng)驗(yàn)證大腦前回組織表達(dá)的差異蛋白有29個(gè),主要涉及能量代謝、細(xì)胞骨架、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、生物合成、神經(jīng)遞質(zhì)、

10、應(yīng)激和功能未知蛋白。其中,缺氧7d時(shí),有氧氧化、細(xì)胞骨架、生物合成的蛋白質(zhì)表達(dá)下調(diào),14d時(shí)表達(dá)有上調(diào)趨勢(shì),無(wú)氧酵解、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的蛋白質(zhì)表達(dá)上調(diào)。
　　結(jié)論：
　　1.設(shè)計(jì)并成功建成可用于大、中、小型動(dòng)物缺氧性實(shí)驗(yàn)的大型全自動(dòng)常壓低氧生物醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)艙,艙內(nèi)氧濃度可調(diào)節(jié)范圍2～20％,工作性能穩(wěn)定、可靠,可連續(xù)運(yùn)行504h,國(guó)內(nèi)尚未見(jiàn)同類報(bào)道。
　　2.明確了大鼠對(duì)不同程度缺氧環(huán)境的耐受力及耐受時(shí)間:氧濃度在3％-6％時(shí),動(dòng)

11、物全部死亡,屬極重度缺氧。氧濃度在7％時(shí),屬重度缺氧,動(dòng)物1w內(nèi)的死亡率是30％。8％-10％時(shí),屬中度缺氧,動(dòng)物1w內(nèi)無(wú)死亡。
　　3.氧濃度為7％時(shí),實(shí)驗(yàn)動(dòng)物雖有少數(shù)死亡,但存活動(dòng)物經(jīng)歷典型的缺氧急性代償性和適應(yīng)性變化過(guò)程,是研究哺乳動(dòng)物對(duì)缺氧適應(yīng)的適宜濃度。
　　4.不同腦區(qū)對(duì)缺氧的敏感性依次為大腦前回>小腦>延腦>大腦頂葉>海馬。各腦區(qū)均于持續(xù)缺氧7d時(shí)損傷最重,于第10d已見(jiàn)修復(fù),前回修復(fù)早于其它腦區(qū),小腦、延腦、

12、大腦頂葉和海馬相對(duì)延遲。雄性大鼠對(duì)缺氧的適應(yīng)早于雌性。
　　5.缺氧過(guò)程中,腦組織各類細(xì)胞均可發(fā)生缺氧性改變,其中神經(jīng)元的變性重于神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞,小腦蒲肯野細(xì)胞重于顆粒細(xì)胞。
　　6.經(jīng)生理、病理學(xué)系統(tǒng)對(duì)比性動(dòng)態(tài)觀測(cè)表明,腦組織的缺氧性損傷病變具有累及部位的全腦性、損傷細(xì)胞的廣泛性、病程發(fā)展的階段性以及不同腦區(qū)不同類型細(xì)胞對(duì)缺氧敏感程度的差異性四個(gè)主要特點(diǎn)。
　　7.在缺氧過(guò)程中,動(dòng)脈血pH值和Ca2+濃度均低于對(duì)照組,

13、表明細(xì)胞損傷與細(xì)胞酸中毒、胞內(nèi)Ca2+超載有關(guān),Ca2+超載可能是細(xì)胞損傷的直接原因。
　　8.7％氧濃度環(huán)境可致大鼠大腦前回組織總蛋白表達(dá)譜發(fā)生變化,雌性差異蛋白點(diǎn)多于雄性。經(jīng)鑒定,發(fā)現(xiàn)29個(gè)差異蛋白,分別涉及能量代謝,信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞骨架、生物合成、神經(jīng)遞質(zhì)及不明功能的蛋白,其中涉及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的蛋白多達(dá)7個(gè),提示,上述各類差異蛋白參與了缺氧所致腦損傷及其適應(yīng)的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程。
　　9.缺氧7d時(shí),與有氧氧化的細(xì)胞色素C氧化酶