原發(fā)性膽汁性肝硬化比較蛋白質(zhì)組學的基礎(chǔ)與臨床研究.pdf

1、研究背景及目的: 原發(fā)性膽汁性肝硬化(Primary biliary cirrhosis，PBC)是一種主要以肝內(nèi)中小膽管的非化膿性進行性炎性損傷為特征的自身免疫性疾病。PBC起病隱匿，進展緩慢，最終可導致肝硬化等終末期肝病，其確切的發(fā)病機制至今尚不清楚。目前，PBC的診斷主要依據(jù)臨床生化及抗線粒體抗體(AMA)的檢測，但是臨床上仍有部分AMA陰性的PBC患者容易漏診。熊去氧膽酸(UDCA)是其主要治療藥物，但是其對某些PBC的

2、遠期治療效果并不理想。 因而如何早期診斷PBC，如何進行有效的干預處理是PBC研究的一個方向。由于人體諸多生命功能最終是通過蛋白質(zhì)來完成的，在疾病的發(fā)生過程中，人體內(nèi)蛋白質(zhì)的種類和含量也會發(fā)生相應(yīng)的改變，這就為我們對PBC的研究提供了一個思路。而蛋白質(zhì)組學(Proteomics)正是以蛋白質(zhì)組為研究對象，分析細胞內(nèi)、外動態(tài)變化的蛋白質(zhì)組成、表達水平與修飾狀態(tài)，了解蛋白質(zhì)分子之間的相互作用與聯(lián)系。迄今國內(nèi)外有關(guān)蛋白質(zhì)組學技術(shù)研究P

3、BC的相關(guān)報道較少。我們從蛋白質(zhì)組學的角度出發(fā)，利用同位素標記相對和絕對定量(iTRAQ)聯(lián)合液帽色譜-質(zhì)譜(LC-MS/MS)技術(shù)通過比較PBC、HBV肝纖維化、HBV肝硬化患者和正常對照人群的血清蛋白質(zhì)，篩選、鑒定PBC患者血清差異表達蛋白，并進行驗證，旨在對PBC發(fā)病機制和診治研究提供某些理論依據(jù)。 與此同時，疾病的動物模型也是研究疾病的一個重要方法。目前PBC動物模型大致分為三類：抗原免疫、化學物質(zhì)誘導和基因缺陷。但是這

4、些動物模型在肝臟病理變化和/或血清學生化以及自身抗體的表達等方面與人類：PBC總是存在一定差異。國外有文獻報道部分肝炎患者在利用IFN-α治療的過程中會繼發(fā)PBC，而我們在臨床工作中也有類似發(fā)現(xiàn)，這給了我們一個建立PBC動物模型的啟示-通過Poly I：C腹腔注射，誘導小鼠體內(nèi)IFN-α水平升高，進而建立PBC動物模型。同時，利用iTRAQ和LC-MS/MS技術(shù)對不同階段PBC動物模型及其對照組血清及肝臟組織中的蛋白質(zhì)進行比較，篩選、鑒

5、定PBC動物模型血清及肝組織差異表達蛋白，并進行驗證，以期通過PBC動物模型的研究對人PBC可能的發(fā)病機制和診斷有所啟示。 方法: 一、PBC動物模型建立 1、6-8周齡C57BL/6雌性小鼠80只，體重約20g，隨機分為PBS對照組和Poly I：C模型組，SPF級飼養(yǎng)。PBS液稀釋Poly I：C至1mg/ml。模型組給予Poly I：C5mg/kg腹腔內(nèi)注射2次/周，對照組給予PBS5mg/kg腹腔內(nèi)注射2

6、次/周；每組分別與第4周、8周、12周和16周各處死10只。 2、血清樣品制備眼球摘除取血，4℃1400g離心5分鐘，取血清，部分血清行生化及自身抗體檢測，部分血清立即置于-80℃保存?zhèn)溆谩?3、肝臟組織樣品制備斷頸處死后，取肝臟于冰生理鹽水中清洗，部分肝臟置入4％福爾馬林液固定，石蠟包埋，行HE染色和CK19免疫組化染色，光鏡下觀察肝臟病理變化及肝內(nèi)膽管變化；部分肝臟立即置于-80℃保存?zhèn)溆谩?二、PBC動物模

7、型血清及肝臟組織差異表達蛋白篩選、鑒定 1、血清及肝臟組織樣品制備將每組血清各自混合，4℃1400g離心5分鐘，過柱去除高豐度蛋白；肝臟組織于PBS中剪碎洗去血液；液氮研磨混合；按照裂解液體積：組織重量(v：w)=5：1的關(guān)系加入裂解液(7M尿素，2M硫脲，0.1％PMSF，0.5％DTT)，混懸，冰上裂解半小時。 2、樣品蛋白質(zhì)定量通過Bradford法測定各組樣品中的總蛋白含量。 3、蛋白質(zhì)的消化和標記加入還

8、原試劑，60℃反應(yīng)1小時；加入半胱氨酸封閉試劑，室溫處理10分鐘；每管各加入預冷的丙酮(丙酮：樣品體積比=5：1)，-20℃沉淀1小時后，12000 rpm，4℃，離心20分鐘，取沉淀；加入溶解液20μl，混懸，充分溶解樣品；按照酶：蛋白質(zhì)=1：20的比例加入胰蛋白酶，37℃酶解過夜；iTRAQTM Reagent114，115，116，117分別標記正常對照、4周、12周和16周模型組，共4管，各管標記試劑中加入70μl乙醇，混勻，分

9、別加入各管樣品中，室溫反應(yīng)一小時，之后各加入三倍體積水，使標記試劑分解；合并各管標記好的樣品，真空冷凍干燥。 4、差異表達蛋白質(zhì)譜分析、篩選及鑒定不同標記的iTRAQ標記蛋白樣品混合，經(jīng)第一維強陽離子柱(SCX)分離，共收取14個梯度進行第二維分析；第二維反相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(RPLC-MS)，色譜分離70分鐘后行質(zhì)譜鑒定，MS掃描范圍m/z400-1800，MS/MS掃描范圍m/z100-2000。經(jīng)生物信息學處理，篩選出統(tǒng)計學

10、上差異明顯的蛋白質(zhì)峰進行搜庫、鑒定。 三、人PBC血清差異表達蛋白篩選、鑒定及驗證 1、血清樣品制備正常人群對照、PBC、HBV肝纖維化和HBV肝硬化患者各20例，清晨空腹取血，4℃靜置1小時，4℃1400g離心5分鐘，取上清，分裝后立即置于-80℃保存?zhèn)溆?；將每組血清各自混合成1管，4℃1400g離心5分鐘，過柱去除高豐度蛋白。 2、樣品蛋白質(zhì)定量參見動物模型樣品蛋白質(zhì)定量。 3、蛋白質(zhì)的消化和標記參見

11、動物模型的蛋白質(zhì)消化及標記。 4、差異表達蛋白質(zhì)譜分析、篩選及鑒定參見動物模型質(zhì)譜分析方法。 5、利用Western免疫印跡技術(shù)驗證淋巴管內(nèi)皮透明質(zhì)酸受體1(LYVE-1)和鋅-α2糖蛋白(AZGP1)在PBC患者與正常人群血清中的表達差異；利用ELISA法驗證視黃醇結(jié)合蛋白4(RBP4)在PBC患者與正常人群血清中的表達差異。 結(jié)論: 1、Poly I：C腹腔注射C57BL/6小鼠能夠成功構(gòu)建與人PBC

12、在組織病理和血清學表現(xiàn)類似的PBC動物模型。 2、iTRAQ結(jié)合LC-MS/MS技術(shù)能夠快速、有效地進行差異蛋白質(zhì)組學研究，同時，我們利用Western免疫印跡技術(shù)和ELISA方法對部分鑒定蛋白進行驗證的結(jié)果也證明了iTRAQ結(jié)合LC-MS/MS技術(shù)在蛋白定性及半定量的蛋白質(zhì)組學研究方面的可靠性。 3、PBC動物模型與對照組動物之間在血清及肝組織的蛋白質(zhì)表達上均存在明顯差異，在蛋白質(zhì)生物學功能上分別涉及脂質(zhì)轉(zhuǎn)運和代謝、免

13、疫應(yīng)答、細胞粘附和運動、能量代謝等諸多方面；而且部分差異蛋白表達水平與PBC動物模型的進程呈現(xiàn)出明顯的正相關(guān)或負相關(guān)性，這對于后續(xù)對該PBC模型的發(fā)生機制進行進一步的功能蛋白質(zhì)組學研究打下了基礎(chǔ)。 4、PBC患者、HBV肝纖維化患者、HBV肝硬化患者及正常人群其相互之間在血清蛋白質(zhì)表達上均存在顯著差異，在蛋白質(zhì)生物學功能上分別涉及脂質(zhì)轉(zhuǎn)運及代謝、載體類、細胞粘附及運動、免疫應(yīng)答、凝血相關(guān)、蛋白水解酶類等諸多方面；特別是相對于正常

14、人群、HBV肝纖維化及HBV肝硬化患者，我們發(fā)現(xiàn)FN1、GC、LYVE1、A2M、AGT、AlBG、ApoC-Ⅲ、ApoC-Ⅱ和IGHM等9個蛋白質(zhì)在PBC患者血清中與上述三組均存在顯著的表達差異，這些蛋白質(zhì)可能與PBC的發(fā)病機制密切相關(guān)，有待于進一步研究。 5、通過對PBC患者血清差異蛋白質(zhì)組學與：PBC動物模型血清和肝組織差異蛋白質(zhì)組學的比較研究，我們發(fā)現(xiàn)，諸如ApoC等載脂蛋白家族蛋白在PBC患者及PBC動物模型中均呈現(xiàn)低