廣西巴馬小型豬α-1,3半乳糖轉(zhuǎn)移酶基因過(guò)表達(dá)載體和RNAi載體的構(gòu)建及其沉默效率檢測(cè).pdf

1、α-1，3半乳糖轉(zhuǎn)移酶(α-1，3－galactosyltransferase，α-1，3GT)基因又被稱為GGTA1基因，其編碼的α-1，3半乳糖轉(zhuǎn)移酶負(fù)責(zé)催化細(xì)胞表面Galα1－3Gal－β1－4GlcNAc-R結(jié)構(gòu)的糖表位，即α-Gal表位合成。由于人類在進(jìn)化過(guò)程中GGTA1基因失活，α-Gal表位丟失，并相應(yīng)地產(chǎn)生了大量該表位的天然抗體，因此，α-13-半乳糖苷轉(zhuǎn)移酶是異種器官移植中產(chǎn)生超急性免疫排斥(hyperacute re

2、jection，HAR)的主要誘因。為探討應(yīng)用RNAi技術(shù)沉默GGTA1基因的效率，本研究針對(duì)廣西巴馬小型豬α-1，3GT基因，設(shè)計(jì)并構(gòu)建了GGTA1基因過(guò)表達(dá)載體以及特異性RNAi干擾載體，并在細(xì)胞水平對(duì)其沉默效率進(jìn)行檢測(cè)，為將來(lái)進(jìn)一步獲得α-1，3GT基因沉默巴馬小型豬，構(gòu)建異種器官移植用巴馬小型豬模型奠定基礎(chǔ)。
　　 本試驗(yàn)根據(jù)NCBI上發(fā)布的豬α-1，3GT基因cDNA序列設(shè)計(jì)引物，且在引物上下游分別加入HindⅢ與Ba

3、mHI兩個(gè)酶切位點(diǎn)。以廣西巴馬小型豬肝臟組織中的總RNA為模板，進(jìn)行RT-PCR。產(chǎn)物經(jīng)純化，連接，轉(zhuǎn)化和擴(kuò)增后測(cè)序。測(cè)序結(jié)果顯示分別成功克隆得到了廣西巴馬小型豬缺失第五外顯子(GGTA1-1，1080bp)的GGTA1基因cDNA序列及完整的GGTA1基因cDNA序列(GGTA1-2，1116bp)；將測(cè)序正確的陽(yáng)性克隆質(zhì)粒pMD18-GGTA1-1、pMD18-GGTA1-2和pDsRed1-N1載體經(jīng)HindⅢ和BamHI雙酶切，

4、純化連接并構(gòu)建pDsRed1-GGTA1-1及pDsRed1-GGTA1-2重組真核表達(dá)載體；最后，利用脂質(zhì)體(Lipofectamine2000)介導(dǎo)法將重組質(zhì)粒導(dǎo)入PK-15細(xì)胞中培養(yǎng)，經(jīng)轉(zhuǎn)染24h后，置于倒置顯微鏡下觀察其在細(xì)胞中的表達(dá)情況。結(jié)果表明重組質(zhì)粒pDsRed1-GGTA1-1、pDsRed1-GGTA1-2的均能在PK-15細(xì)胞中表達(dá)，為下一步進(jìn)行α-1，3GT基因的沉默實(shí)驗(yàn)奠定基礎(chǔ)。
　　 為了篩選能有效抑制

5、GGTA1基因表達(dá)的小干擾RNA，本研究利用RNAi技術(shù)在PK-15細(xì)胞中沉默該基因，并對(duì)其沉默效率進(jìn)行了檢測(cè)。首先，以pLLU2G載體為骨架，設(shè)計(jì)并構(gòu)建了pLLU2G-shGGTA1-1、pLLU2G-shGGTA1-2和pLLU2G-shGGTA1-3共3個(gè)針對(duì)巴馬小型豬GGTA1基因的RNAi載體及陰性對(duì)照載體pLLU2G－shGGTA1－control。載體通過(guò)脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染PK－15細(xì)胞，以pDsRed1－GGTA1－1作為陽(yáng)性

6、對(duì)照，lipofectamine2000與DMEM分別空轉(zhuǎn)作為空白對(duì)照。然后分別應(yīng)用熒光定量PCR(qRT－PCR)與Western blot對(duì)其進(jìn)行沉默效率檢測(cè)。熒光定量PCR結(jié)果顯示，pLLU2G－shGGTA1－1、pLLU2G－shGGTA1－2和pLLU2G－shGGTA1－3抑制效率分別為85.02％、86.05％和83.85％。陰性對(duì)照pLLU2G－shGGTA1－Control、lipofectamine2000空白對(duì)照

7、組一與空轉(zhuǎn)染DMEM空白組二無(wú)抑制效果，陽(yáng)性對(duì)照組pDsRed1－GGTA1－1高表達(dá)GGTA1基因。Western blot檢測(cè)結(jié)果表明，pLLU2G-shGGTA1-1、pLLU2G-shGGTA1-2和pLLU2G-shGGTA1-3這3個(gè)干擾實(shí)驗(yàn)組GGTA1蛋白幾乎為痕量表達(dá)，這與熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果一致。陰性對(duì)照組pLLU2G-shGGTA1-Control、lipofectamine2000空白對(duì)照組一與空轉(zhuǎn)染DMEM空白