人ACE2轉(zhuǎn)基因小鼠對(duì)SARS-CoV的易感性及SARS發(fā)病機(jī)制的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、嚴(yán)重急性呼吸綜合征(severe acute respiratow syndrome，SARS)是本世紀(jì)初爆發(fā)的由一種新的冠狀病毒引起的傳染性疾病，主要的靶器官是肺臟，病死率達(dá)10％左右。SARS已經(jīng)淡出人們的生活已有四年多了，目前的研究主要集中在SARS發(fā)病機(jī)制和抗病毒藥物、疫苗的研發(fā)上，而這些研究的基礎(chǔ)是可靠的SARS動(dòng)物模型。已有文獻(xiàn)報(bào)道非人靈長(zhǎng)類(恒河猴、食蟹猴、絨猴、非洲綠猴)、小鼠(BABL/c、C57/B6、基因修飾小鼠)

2、、倉(cāng)鼠、貍子貓、雪貂等均能支持SARS-CoV的復(fù)制，其中有些動(dòng)物顯示了不同程度的病理變化，但在臨床疾病和病理上仍缺乏與SARS病人的相似性。 據(jù)研究，SARS-CoV是通過(guò)其表面的S蛋白和靶細(xì)胞的表面受體血管緊張素轉(zhuǎn)換酶2(ACE2)結(jié)合侵入宿主細(xì)胞的，這提示人ACE2(hACE2)轉(zhuǎn)基因鼠有可能作為對(duì)SARS-CoV易感的動(dòng)物模型，因此進(jìn)行了hACE2轉(zhuǎn)基因鼠對(duì)SARS-CoV易感性的實(shí)驗(yàn)研究并利用此動(dòng)物模型探討了SARS的

3、發(fā)病機(jī)制。 本研究主要包括以下三個(gè)部分的實(shí)驗(yàn)內(nèi)容： 1．hACE2轉(zhuǎn)基因小鼠的制備和鑒定：選擇小鼠ACE2(mACE2)啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的hACE2全長(zhǎng)編碼序列(Coding sequence，CDS)基因片斷，通過(guò)顯微注射的方法，制備攜帶hACE2基因的轉(zhuǎn)基因小鼠。經(jīng)PCR檢測(cè)到4個(gè)陽(yáng)性首建鼠； RT-PCR及Nested RT-PCR結(jié)果顯示在其中一個(gè)Founder的子代鼠的肺、心、腎和小腸有hACE2基因表達(dá)；Realt

4、ime-PCR檢測(cè)此Founder子代鼠轉(zhuǎn)基因的拷貝數(shù)，結(jié)果顯示為單拷貝轉(zhuǎn)基因小鼠；Western blot結(jié)果顯示hACE2蛋白在轉(zhuǎn)基因小鼠的不同組織包括肺、心、腎和小腸均有表達(dá)；免疫組化顯示，在轉(zhuǎn)基因小鼠的腎臟近曲小管上皮細(xì)胞、肺臟小血管內(nèi)皮細(xì)胞可見(jiàn)hACE2蛋白表達(dá)；無(wú)創(chuàng)性血壓監(jiān)測(cè)觀察發(fā)現(xiàn)，hACE2轉(zhuǎn)基因小鼠的心率、血壓與野生鼠相比未見(jiàn)明顯差異；病理組織學(xué)檢查未發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因小鼠心、肺、腎等器官組織結(jié)構(gòu)異常。 2.hACE

5、2轉(zhuǎn)基因小鼠對(duì)SARS-CoV易感性的實(shí)驗(yàn)：經(jīng)鼻腔接種PUMC01株SARS-CoV后，野生型和轉(zhuǎn)基因小鼠接種SARS-CoV后均未出現(xiàn)死亡現(xiàn)象。在接種后的第3天和第7天，RT-PCR和免疫熒光試驗(yàn)(IFA)結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)基因小鼠肺組織上清的病毒載量和病毒滴度明顯高于野生型小鼠(P<0.05)；在接種后的第7天，轉(zhuǎn)基因小鼠的感染率明顯高于野生型小鼠(P<0.01)；轉(zhuǎn)基因小鼠出現(xiàn)典型的間質(zhì)性肺炎，而且伴有腎臟、心臟、肝臟、腦組織和胃腸道等

6、肺外組織的損傷。而部分野生型小鼠只在感染后第三天出現(xiàn)輕微的間質(zhì)性肺炎。通過(guò)免疫組化染色，在轉(zhuǎn)基因小鼠的肺臟上皮細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞及大腦神經(jīng)細(xì)胞可發(fā)現(xiàn)SARS-CoV抗原；接種病毒后在部分感染小鼠的血清中可檢測(cè)到SARS-CoV特異性的抗體IgG和IgM，但轉(zhuǎn)基因小鼠抗體陽(yáng)性率低于野生型小鼠。上述資料表明，hACE2轉(zhuǎn)基因小鼠對(duì)SARS-CoV的易感性明顯高于野生型小鼠。 3．利用hACE2轉(zhuǎn)基因小鼠探討非特異性的免疫反應(yīng)在SAR

7、S發(fā)病中的作用：應(yīng)用ELISA的方法，觀察到轉(zhuǎn)基因小鼠接種病毒后，肺組織上清細(xì)胞因子IL-6、TNF-α和IFN-γ明顯升高；Western Blot和免疫組化染色檢測(cè)到轉(zhuǎn)基因小鼠感染SARS-CoV后肺組織一氧化氮合酶(iNOS)表達(dá)明顯增強(qiáng)，陽(yáng)性顆粒主要位于肺泡巨噬細(xì)胞；比色法測(cè)定到轉(zhuǎn)基因小鼠感染SARS-CoV后血漿中NO含量明顯增多。 綜上所述，hACE2在我們制備的轉(zhuǎn)基因小鼠體內(nèi)部分組織表達(dá)，盡管接種病毒后具有缺少病死