ACE2基因變異與SARS冠狀病毒進入及肺部病變嚴重程度之間的關系研究.pdf

1、嚴重急性呼吸綜合征(severeacuterespiratorysyndrome，SARS)是由一種新的SARS冠狀病毒(coronavirus，CoV)引起的急性傳染病，在人群中傳染性極強，其病死率高達10％。彌漫性肺泡損傷(diffusealveolardamage，DAD)是導致患者出現(xiàn)呼衰及死亡的主要原因之一，其發(fā)病機制至今尚未闡明。在SARS-CoV被分離后不久，人們就鑒定出了SARS受體一血管緊張素轉換酶2(angioten

2、sin-conVertingenzyme2，ACE2)。體外研究提示，SARS假病毒在小鼠和大鼠ACE2基因轉染的細胞上其病毒進入效率較人ACE2(hu-ACE2)基因轉染的細胞明顯降低，這些結果初步提示不同物種間ACE2基因的變異與SARS-CoV進入細胞的效率密切相關，同時這也可能是大鼠和小鼠對SARS-CoV不易感的原因之一。體內(nèi)研究顯示SARS-CoV感染小鼠急性期可引起ACE2表達下調(diào)；SARS-CoVS蛋白也可引起ACE2表

3、達下調(diào)和急性肺損傷加重，運用ACE2底物抑制劑可明顯減輕急性肺損傷的程度。這些研究充分體現(xiàn)ACE2在SARS發(fā)病過程中扮演了重要角色。但這些研究僅局限于小鼠，尚不足以外推到人。由我們以前的研究可知，中國恒河猴被SARS-CoV感染后可出現(xiàn)輕度或重度間質性肺炎。為了進一步明確ACE2在SARS發(fā)病中的作用，我們選擇輕度和重度SARS恒河猴為研究對象，分析恒河猴ACE2(rh-ACE2)基因變異與病毒進入之間的關系。我們希望通過對rh-AC

4、E2基因變異與病毒進入效率之間關系的研究，從而發(fā)現(xiàn)一些與病毒進入密切相關的氨基酸位點。進而突變hu-ACE2基因的該位點殘基，觀察其對病毒進入的影響，希望找到hu-ACE2上對病毒進入有重要影響的氨基酸位點。最后我們將進一步分析rh-ACE2基因突變與SARS病變嚴重程度之間的關系。 本次研究中我們以肺部病理變化為基礎，選取6只輕度、6只重度SARS恒河猴及2只正常對照恒河猴作為研究對象。輕度肺損傷的病理特征為肺聞隔增寬伴單核巨

5、噬細胞浸潤；重度肺損傷以彌漫性肺泡損傷為其特征，主要病理特征為彌漫性肺間隔增寬伴單核巨噬細胞浸潤、局部肺聞隔融合、肺泡腔內(nèi)可見蛋白水腫液及纖維素滲出。運用RT-PCR從這些恒河猴腎組織中擴增出全長rh-ACE2基因，克隆并分析其變異規(guī)律。序列分析結果提示，在14只恒河猴中，我們共檢測到55個隨機非同義突變。以序列相對保守的8號恒河猴的8-2克隆為rh-ACE2代表，與hu-ACE2序列相比我們在8-2克隆的rh-ACE2序列中共查及38

6、個一致性非同義突變。每只恒河猴選取2個代表性質粒轉染HEK293T細胞后，觀察基因表達水平及病毒進入效率的變化。結果發(fā)現(xiàn)11號恒河猴11-7克隆的ACE2表達水平和病毒進入效率較11-1克隆明顯降低。序列分析結果提示，與11-1克隆相比，11-7克隆出現(xiàn)R192G、Y217N兩個位點突變。定點突變分析顯示：Y217N突變是引起rh-ACE2基因11-7克隆蛋白表達和病毒進入降低的關鍵性氨基酸位點。我們突變hu-ACE2基因獲得hu-AC

7、E2(Y217N)突變型質粒，轉染細胞后發(fā)現(xiàn)hu-ACE2(Y217N)基因的表達水平和病毒進入效率較hu-ACE2基因明顯下降。最后，我們分析Rh-ACE2基因變異與肺部損傷嚴重程度之間的關系。結果顯示：有1只(1/6)輕度病變的恒河猴rh-ACE2編碼區(qū)第1677位核苷酸位點存在A/G雜合性位點，有3只(3/6)重度病變的SARS恒河猴rh-ACE2編碼區(qū)第1677位核苷酸位點存在A/G雜合性位點。Fisher確切概率法檢驗提示，輕