登革病毒基因變異、病毒載量及機(jī)體固有免疫與登革熱嚴(yán)重程度的相關(guān)性研究.pdf

1、登革熱（DF）是由登革病毒（DENV）經(jīng)蚊媒傳播的一種急性傳染病，DENV依抗原性不同可分為四種血清型（DENV-1～DENV-4），每個(gè)血清型都可引起從無(wú)癥狀感染到致死性疾病的一系列廣泛的臨床表現(xiàn)譜。2009年世界衛(wèi)生組織將有癥狀的DENV感染簡(jiǎn)單分為DF和重癥登革熱（SD），DF為疾病的輕癥形式，表現(xiàn)為一種發(fā)熱性自限性疾病，主要癥狀有高熱、頭痛、乏力、皮疹等，病程持續(xù)一周左右，而SD特征為在熱退后出現(xiàn)以嚴(yán)重出血、血漿滲漏和器官損傷為

2、特征的重癥表現(xiàn)，病死率較高，但SD的發(fā)病機(jī)制尚未闡明，目前認(rèn)為主要與二次異型 DENV感染、病毒毒力和免疫病理等因素有關(guān)。廣東省尤其是廣州市是我國(guó)登革熱的高發(fā)區(qū)，每年都有登革病例報(bào)告，3至5年出現(xiàn)一個(gè)發(fā)病高峰，以DENV-1為主。近幾年來(lái)流行趨勢(shì)加重，2013-2014年連續(xù)兩年爆發(fā)流行，尤其是2014年，為廣州史上最嚴(yán)重的登革熱疫情，出現(xiàn)較多的重癥病例，DENV流行的本地化問(wèn)題一直沒(méi)有得到解決，且我國(guó)DF患者的臨床及實(shí)驗(yàn)室特征與東南亞

3、等流行區(qū)不同。在東南亞及南美洲等國(guó)家和地區(qū)，DF通常被認(rèn)為是一個(gè)兒科疾病，較少侵襲成人，重癥也主要發(fā)生在兒童和青少年病例，目前對(duì)SD發(fā)病機(jī)制的理解基本都來(lái)源于東南亞兒童SD的研究；而我國(guó)DF病例以成人為主，SD發(fā)生機(jī)制可能與流行區(qū)不同，但目前尚無(wú)相關(guān)研究報(bào)道。因此，研究我國(guó)成人DF患者病原特點(diǎn)和免疫反應(yīng)規(guī)律，闡明SD的發(fā)病機(jī)制，尋求SD預(yù)警指征從而對(duì)SD進(jìn)行早期診斷、預(yù)防和治療以降低SD的病死率是亟待解決的問(wèn)題。
　　目的：分析2

4、013-2014年廣州流行的DENV-1分子特征，探討DENV本地流行的分子學(xué)證據(jù)；分析DENV基因變異、病毒載量和機(jī)體固有免疫與DF嚴(yán)重程度的相關(guān)性，探討我國(guó)SD患者的發(fā)病機(jī)制，從而為SD的臨床救治提供科學(xué)依據(jù)。
　　方法：應(yīng)用Ion Torrent深度測(cè)序法對(duì)廣州2013-2014年流行的DENV-1進(jìn)行全基因組測(cè)序，與 Genbank中報(bào)道的有全基因序列的DENV-1毒株進(jìn)行遺傳進(jìn)化分析，探討此次 DENV爆發(fā)和流行的分子學(xué)

5、依據(jù)；對(duì) DF和 SD患者來(lái)源的DENV-1全基因序列進(jìn)行基因位點(diǎn)多態(tài)性、基因表達(dá)差異和遺傳多樣性比較，分析DENV基因序列變異對(duì)疾病嚴(yán)重程度的影響。應(yīng)用DENV IgM和IgG抗體捕獲ELISA試劑盒檢測(cè)住院患者IgM和IgG抗體水平了解我國(guó)患者初次感染及二次感染分布情況，比較DF和SD患者之間的二次感染百分率差異以分析其與疾病嚴(yán)重程度的相關(guān)性，探討二次異型DENV感染機(jī)制在我國(guó)SD發(fā)生中的作用。應(yīng)用熒光定量RT-PCR對(duì)患者發(fā)病第1

6、-10天的血清進(jìn)行DENV血清型分型和載量檢測(cè)，觀察病毒載量在疾病過(guò)程中的動(dòng)態(tài)變化規(guī)律、比較DF和SD患者病毒載量差異，以了解疾病進(jìn)程中 DENV與機(jī)體的相互作用，探討其與疾病嚴(yán)重程度的相關(guān)性。應(yīng)用Luminex多因子檢測(cè)技術(shù)檢測(cè)DF和SD患者疾病進(jìn)程中不同時(shí)間點(diǎn)的外周血中炎癥介質(zhì)和粘附分子水平探討機(jī)體炎癥反應(yīng)與疾病嚴(yán)重程度的相關(guān)性。應(yīng)用PCR array檢測(cè)患者病程中外周血單個(gè)核細(xì)胞中模式識(shí)別受體及其信號(hào)通路相關(guān)基因的表達(dá)水平，分析其

7、與疾病嚴(yán)重程度的相關(guān)性，探討固有免疫分子機(jī)制在DF尤其是SD發(fā)病中的作用。
　　結(jié)果：（1）2013-2014年廣州流行的DENV-1有兩種基因型，即基因I型和III型，其中基因III型DENV-1在2013年首次出現(xiàn)，其特征是在3’-UTR末端高變區(qū)發(fā)生21個(gè)核苷酸的缺失，遺傳進(jìn)化分析推測(cè)其可能是在2013年由新加坡傳入廣州并造成2014年廣州登革大流行。（2）基因I型DENV-1序列遺傳多樣性在DF和SD患者中存在差異，但基因

8、III型DENV-1序列沒(méi)有表現(xiàn)出明顯的差異。（3）登革患者IgM抗體水平隨著病程進(jìn)展迅速升高，至第6天時(shí)陽(yáng)性百分率即達(dá)95％以上；IgG抗體水平較 IgM上升相對(duì)緩慢，陽(yáng)性百分率也相對(duì)較低；我國(guó)登革患者以初次感染為主，DF和SD患者二次感染百分率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。（4）DENV載量在發(fā)病起始時(shí)達(dá)到峰值，隨疾病恢復(fù)快速下降，SD患者病毒載量在發(fā)熱期與DF患者并無(wú)明顯差異，但極期時(shí)顯著高于DF患者；初次感染患者較二次感染者有更高的病毒載量

9、。（5）與健康對(duì)照相比，登革患者炎癥介質(zhì)和血管內(nèi)皮細(xì)胞粘附分子水平顯著升高，但DF和SD患者表現(xiàn)出不同的動(dòng)力學(xué)變化特征，DF患者隨病情恢復(fù)水平逐漸下降，但SD患者高水平炎癥介質(zhì)持續(xù)時(shí)間較長(zhǎng)。（6）登革熱患者基因表達(dá)水平較健康對(duì)照顯著升高，隨病情恢復(fù)，表達(dá)水平逐漸下降，與病程進(jìn)展有明顯的相關(guān)性；機(jī)體主要通過(guò)TLR7/8、RIG-I和 MDA5受體識(shí)別病毒來(lái)源分子，激活相應(yīng)的信號(hào)通路，引起 IFN-I和炎癥介質(zhì)產(chǎn)生以抵抗病毒感染；SD患者基