乳鐵蛋白試紙條的研制和臨床研究.pdf

1、干眼(dryeye)是指由于淚液的質(zhì)或量異常，或淚液的動力學(xué)異常引起的淚膜不穩(wěn)定及眼表面的損害，從而導(dǎo)致眼不適等癥狀的一類疾病[1]。干眼是目前世界和我國最為常見的眼表疾病。流行病學(xué)及臨床調(diào)查發(fā)現(xiàn)美國65～84歲的人群中，14.6％(430萬)的人患干眼病[2]。我國迄今尚無干眼流行病學(xué)的調(diào)查結(jié)果。但基于我國的衛(wèi)生條件和環(huán)境狀況，其發(fā)病率可能較文獻報道的高，而且，隨著環(huán)境污染的加重、人們使用電腦的頻率的增加，干眼的發(fā)病率還會進一步的增加

2、。干眼是一種病因復(fù)雜、癥狀多樣，嚴(yán)重影響著人們的生活質(zhì)量的疾病。但是，目前干眼的診斷較為困難。其原因是由于臨床醫(yī)師缺乏對干眼的認(rèn)識、診斷標(biāo)準(zhǔn)的準(zhǔn)確性和精確性的不足及檢查指標(biāo)變異性較大所致。因此為尋找變異性較小、臨床簡單易行的檢查方法，制定統(tǒng)一的診斷標(biāo)準(zhǔn)已成為目前干眼臨床工作的重要課題。 淚液乳鐵蛋白[3](1actoferrin，LF)是淚液中由漿液性腺體產(chǎn)生的最主要的抗菌蛋白，而且具有廣譜的抗菌、抗病毒、抗氧化作用。淚液乳鐵蛋

3、白主要來源于淚腺和副淚腺的腺泡上皮細(xì)胞，其含量在很大程度上能反映淚腺的外分泌功能，對于維持眼表的健康狀態(tài)具有很重要的價值。大量文獻證實，干眼與乳鐵蛋白含量下降存在相關(guān)性，所以淚液中乳鐵蛋白的含量是診斷干眼一個客觀、敏感的指標(biāo)。 膠體金(colloidgold)由Faulk和Taytor于1971年引入免疫化學(xué)[4]，此后免疫膠體金技術(shù)作為一種新的免疫學(xué)方法，在生物醫(yī)學(xué)各領(lǐng)域得到了日益廣泛的應(yīng)用。而膠體金標(biāo)記技術(shù)(colloidg

4、oldmarkingtechnique)是利用還原劑將氯化金分子聚合成為具有特定大小的膠體金顆粒(goldparticle，GP)，被生物學(xué)大分子(IgA等)包被后，作為一種特異性的探針，用于生物科學(xué)各個領(lǐng)域。膠體金免疫層析法[5](GICA)是近幾年來國際上發(fā)展迅速的快速診斷技術(shù)，原理是將膠體金標(biāo)記的特異的抗體(抗原)，先固定于干燥的硝酸纖維素膜的一段，當(dāng)該端接觸到待檢樣品后，由于毛細(xì)管的虹吸作用，樣品沿著膜向前移動，當(dāng)?shù)竭_固定有相應(yīng)

5、抗體(抗原)的區(qū)域，樣品中相應(yīng)的抗原(抗體)，即與之反應(yīng)發(fā)生特異性結(jié)合，使該區(qū)域顯示一定的顏色，從而實現(xiàn)特異性的免疫診斷。 本課題利用膠體金免疫層析法，成功制備了乳鐵蛋白試紙條，并且驗證了其顯色的濃度范圍和檢測的可重復(fù)性，并將其應(yīng)用于臨床，判斷其診斷干眼的敏感性和特異性，為臨床診斷干眼提供一種簡便、快捷并且客觀的輔助檢查方法。 第一部分乳鐵蛋白試紙條的制備1、研究方法：1.1金溶膠的制備：利用0.01％氯金酸水溶液，用檸

6、檬酸三鈉還原法制備了金溶膠。并通過分光光度計檢查金溶液的吸收峰。 1.2單克隆抗體的膠體金標(biāo)記：將制備好的金溶膠于適當(dāng)濃度的單克隆抗體在適當(dāng)?shù)腜H值條件下進行混合，并進行離心和洗滌，完成單克隆抗體的膠體金標(biāo)記。 1.3多克隆抗體的稀釋和PH值調(diào)定以及噴膜：將配備好的多克隆抗體裝入BIODOT劃膜機噴頭2，預(yù)定位置進行噴膜(硝酸纖維膜)。 1.4二抗的稀釋和PH值調(diào)定以及噴膜：將配備好的二抗裝入BIODOT劃膜機噴

7、頭1，預(yù)定位置進行噴膜(硝酸纖維膜)。 1.5單克隆抗體的標(biāo)定：將標(biāo)記好的單克隆抗體鋪于玻璃纖維素膜上，并與硝酸纖維膜復(fù)合，按4*30mm進行切膜。 1.6乳鐵蛋白試紙條的檢測：用制備好的乳鐵蛋白試紙條檢測配制的各個標(biāo)準(zhǔn)濃度的乳鐵蛋白，測定該試紙條的顯色范圍和檢測重復(fù)性。 2、研究結(jié)果：2.1本實驗制備了金溶膠，其顏色為紅色，直徑為40nm。 2.2膠體金標(biāo)記單克隆抗體，加入的單克隆抗體為20μg/ml，

8、原來的濃縮金標(biāo)抗體溶液的OD值為7.10D，最大吸收峰540nm。 2.3裝配成了乳鐵蛋白試紙條，其顯色濃度為2～200ug/ml之間。0～5ug/ml濃度范圍的檢測顯示，0、1ug/ml的10個試紙條均為陰性，而2～5ug/ml的10個試紙條均為陽性，顯示了較好的重復(fù)性。 3、結(jié)論：本文第一部分，成功制備了應(yīng)用膠體金免疫層析法檢測乳鐵蛋白濃度的試紙條，并測定了其顯色范圍及重復(fù)性，可用于半定量分析溶液狀態(tài)下的乳鐵蛋白濃度

9、，有助于臨床上診斷干眼的應(yīng)用。 第二部分乳鐵蛋白試紙條的初步臨床應(yīng)用1、研究方法：1.1選取29例干眼患者以及30例正常對照，分別簽署了知情同意書。 1.2所有入選者完成了問卷調(diào)查表。 1.3所有入選者進行雙眼SchirmerItest、BUT以及熒光素染色檢查。 1.4毛細(xì)玻璃管法分別采集雙眼的淚液，將采得的淚液用PBS按一定比例稀釋后，進行乳鐵蛋白試紙條的檢測，評價其診斷干眼的敏感性和特異性。

10、 2、研究結(jié)果：2.1如果淚液按1：800稀釋，其診斷干眼的敏感性為22.4％，特異性為91.7％。 2.2如果淚液按1：900稀釋，其診斷干眼的敏感性為24.1％，特異性為75.0％。 2.3如果淚液按1：1000稀釋，其診斷干眼的敏感性為70.7％，特異性為73.3％。 2.4如果淚液按1：1100稀釋，其診斷干眼的敏感性為82.8％，特異性為60.0％。 2.5如果淚液按1：1200稀釋，其診斷干眼

11、的敏感性為93.1％，特異性為35.0％。 2.6如果淚液按1：1300稀釋，其診斷干眼的敏感性為100％，特異性為11.7％。 3、結(jié)論：本部分研究結(jié)果表明，利用乳鐵蛋白試紙條診斷干眼有較高的應(yīng)用價值，如果淚液按1：1000稀釋，用來診斷干眼，其敏感性和特異性分別為70.7％和73.3％。可以作為診斷干眼的一種輔助檢查。 如果淚液按1：1300稀釋，其敏感性可以達到95％左右，可以用來篩查干眼。如果淚液按1：8