蜱鐵蛋白和抗菌多肽cDNA的克隆和分析.pdf

1、1、微小牛蜱鐵蛋白cDNA的克隆和分析從微小牛蜱克隆到一個(gè)新的鐵蛋白編碼基因,cDNA全長(zhǎng)642bp,編碼區(qū)為123-639 nt,編碼172個(gè)氨基酸殘基,該蛋白預(yù)測(cè)的分子量為19.9kDa,等電點(diǎn)為4.24.預(yù)測(cè)氨基酸序列與已報(bào)道的變異革蜱、毛白鈍緣蜱和蓖子硬蜱鐵蛋白同源性分別為93.60％、88.37％和83.72％.該核苷酸序列在mRNA 5′-未翻譯區(qū)的莖環(huán)結(jié)構(gòu)存在鐵應(yīng)答元件,其氨基酸序列上帶有典型的亞鐵氧化酶中心結(jié)構(gòu)的保守序列

2、.經(jīng)RT-PCR分析表明,該基因在微小牛蜱卵、幼蜱、半飽血雌蜱、飽血雌蜱和雄蜱這幾個(gè)階段均有表達(dá).將該基因亞克隆到pET-28a(+)表達(dá)載體,轉(zhuǎn)化BL21(DE3)宿主菌,經(jīng)IPTG誘導(dǎo),可成功表達(dá).重組融合蛋白大小為25kDa左右,與預(yù)期大小一致.Western印跡分析表明,抗微小牛蜱唾液抗體不能識(shí)別重組表達(dá)蛋白.2、鐮形扇頭蜱鐵蛋白cDNA的克隆和表達(dá)從鐮形扇頭蜱克隆到一個(gè)新的鐵蛋白編碼基因,cDNA全長(zhǎng)642bp,編碼區(qū)為123

3、-639 nt,編碼172個(gè)氨基酸殘基,該蛋白預(yù)測(cè)的分子量為19.9kDa,等電點(diǎn)為4.90.預(yù)測(cè)氨基酸序列與已報(bào)道的亞洲璃眼蜱、變異革蜱、斑點(diǎn)鈍眼蜱和微小牛蜱同源性較高,分別達(dá)到98.26％、97.09％、96.51％和95.93％.該核苷酸序列在mRNA 5′-未翻譯區(qū)的莖環(huán)結(jié)構(gòu)存在鐵應(yīng)答元件,其氨基酸序列上帶有典型的亞鐵氧化酶中心結(jié)構(gòu)的保守序列.經(jīng)RT-PCR分析表明,該基因在卵、幼蜱、飽血幼蜱、飽血若蜱、未飽血成蜱、飽血成蜱唾液

4、腺和飽血成蜱殼幾個(gè)階段和蜱的唾液腺、殼中均有表達(dá).將該基因亞克隆到pET-28a(+)表達(dá)載體,轉(zhuǎn)化BL21(DE3)宿主菌,經(jīng)IPTG誘導(dǎo),可成功表達(dá).重組融合蛋白大小為25kDa左右,與預(yù)期大小一致.3、微小牛蜱一個(gè)抗菌多肽cDNA的克隆和分析為了研究蜱與病原相互作用機(jī)制,控制蜱及蜱傳疾病,本研究根據(jù)微小牛蜱巴西株近期報(bào)道的一種結(jié)構(gòu)特殊的抗菌多肽核苷酸序列,從微小牛蜱中國(guó)安徽株克隆到一抗菌多肽基因,全長(zhǎng)383 bp,編碼110個(gè)氨基

5、酸殘基,該蛋白預(yù)測(cè)的分子量為12.2 kDa,等電點(diǎn)為4.87.經(jīng)同源性比較,該微小牛蜱巴西株抗菌多肽基因有100％的相同性.經(jīng)RT-PCR分析表明,該基因在微小牛蜱卵、幼蜱、半飽血雌蜱、飽血雌蜱和雄蜱這幾個(gè)階段均有表達(dá).將該基因亞克隆到pET-28a(+)表達(dá)載體,轉(zhuǎn)化BL21(DE3)宿主菌,經(jīng)IPTG誘導(dǎo),可成功表達(dá).重組融合蛋白大小為15 kDa左右,與預(yù)期大小一致.體外抗菌試驗(yàn)表明,重組蛋白抗菌活性不明顯.Western印跡分