卵轉(zhuǎn)鐵蛋白的分離純化、結(jié)構(gòu)表征及體外抗菌研究.pdf

1、卵轉(zhuǎn)鐵蛋白具有重要的生物活性功能,比如鐵傳遞、抗菌性、及抑制游離基的形成等。雞蛋清中卵轉(zhuǎn)鐵蛋白的含量比較豐富(12％),但關(guān)于蛋清中卵轉(zhuǎn)鐵蛋白分離純化的研究進(jìn)展卻相對(duì)較為緩慢。
　　 本文采用超濾和離子交換層析兩種方法分別對(duì)雞蛋清中的卵轉(zhuǎn)鐵蛋白進(jìn)行分離純化,分離純化卵轉(zhuǎn)鐵蛋白的過(guò)程中分別研究了不同因素對(duì)純化效果的影響,并進(jìn)行優(yōu)化；然后研究了分離純化得到卵轉(zhuǎn)鐵蛋白的理化性質(zhì)及結(jié)構(gòu)表征；研究了卵轉(zhuǎn)鐵蛋白體外抗菌活性。主要研究結(jié)果如下

2、:
　　 1.采用超濾法分離純化卵轉(zhuǎn)鐵蛋白,研究了前處理對(duì)降低蛋清液黏度的影響,發(fā)現(xiàn)稀釋倍數(shù)為15倍、剪切速率為7 kr/min、溫度為45℃時(shí)蛋清液黏度適宜。同時(shí),對(duì)超濾過(guò)程中的工藝條件進(jìn)行研究,其中物料的稀釋倍數(shù)15倍、攪拌速率125r/min、操作壓力0.15 MPa及pH值為7。在單因素的基礎(chǔ)上,選取操作壓力、稀釋倍數(shù)、攪拌速率三個(gè)因素進(jìn)行正交試驗(yàn),對(duì)超濾過(guò)程中的最佳工藝條件進(jìn)行優(yōu)化,優(yōu)化得到的最優(yōu)組合為A3B2C2,由

3、于最優(yōu)組合不在正交表組合內(nèi),通過(guò)驗(yàn)證試驗(yàn)比較最優(yōu)組合A3B2C2和L9(34)表內(nèi)最優(yōu)組合A3B2C1,確定最優(yōu)組合為A3B2C2,即操作壓力為0.15 MPa,稀釋倍數(shù)為10倍,攪拌速率為125 r/min。最后通過(guò)SDS-PAGE凝膠電泳和HPLC對(duì)分離得到的卵轉(zhuǎn)鐵蛋白進(jìn)行了鑒定及純度分析,證實(shí)分離得到的蛋白質(zhì)為卵轉(zhuǎn)鐵蛋白,純度為29.6％。
　　 2.在兩步層析法分離純化蛋清中卵轉(zhuǎn)鐵蛋白時(shí),卵轉(zhuǎn)鐵蛋白先分別用40％飽和度和

4、80％飽和度的硫酸銨進(jìn)行分級(jí)鹽析,然后用Q-Sepharose Fast Flow離子交換樹(shù)脂進(jìn)行兩步層析,第一步層析除掉大部分溶菌酶和抗生物素蛋白,第二步層析用pH8.50.08 mol/L NaCl進(jìn)行洗脫,通過(guò)SDS-PAGE電泳進(jìn)行鑒定,確定了收集到的洗脫峰3為卵轉(zhuǎn)鐵蛋白。通過(guò)HPLC得知分離得到的卵轉(zhuǎn)鐵蛋白的純度為98.3％。
　　 3.研究了卵轉(zhuǎn)鐵蛋白鐵離子的結(jié)合能力,及各種因素對(duì)鐵離子結(jié)合能力的影響。在pH5～9的

5、Tris-H3BO4緩沖液中,發(fā)現(xiàn)在中性和偏堿性的條件下,卵轉(zhuǎn)鐵蛋白的鐵結(jié)合能力比較高；加入濃度分別為0,40,80,120,160 mmol/L的碳酸氫鈉后發(fā)現(xiàn)120 mmol/L的HCO3-濃度對(duì)鐵離子的結(jié)合較為有效；將卵轉(zhuǎn)鐵蛋白置于55℃、60℃、65℃下分別保溫30 min,70℃下毛細(xì)管保溫20 s,快速冷卻到25℃,測(cè)定鐵結(jié)合能力,研究發(fā)現(xiàn)60℃下低溫殺菌能保持卵轉(zhuǎn)鐵蛋白的鐵結(jié)合能力;通過(guò)圓二色譜分析發(fā)現(xiàn)不同鐵飽和度卵轉(zhuǎn)鐵蛋

6、白隨著鐵飽和度的增加,α-螺旋有所升高,β-折疊相應(yīng)的減小,β-轉(zhuǎn)角稍有增加,無(wú)規(guī)卷曲減少,可能是由于隨著鐵飽和度的增加,卵轉(zhuǎn)鐵蛋白伸展的空間結(jié)構(gòu)變的收縮起來(lái)。通過(guò)ANS熒光探針?lè)y(cè)得卵轉(zhuǎn)鐵蛋白表面疏水性指數(shù)為70.35。Zeta電位和平均粒徑測(cè)定表明鐵飽和度增加后,帶正電荷的鐵離子與帶負(fù)電荷的卵轉(zhuǎn)鐵蛋白氨基酸殘基結(jié)合更為緊密,使原本伸展的蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)變得緊密起來(lái),有利于提高蛋白質(zhì)的乳化性。通過(guò)AR1000流變儀測(cè)得卵轉(zhuǎn)鐵蛋白凝膠的臨

7、界質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20％。
　　 4.卵轉(zhuǎn)鐵蛋白的體外抑菌試驗(yàn)表明:其對(duì)大腸桿菌、沙門(mén)氏菌有較好的抑制效果,在較高濃度下對(duì)金黃色葡萄球菌也有一定的抑制作用,對(duì)三種菌的最小抑菌濃度(MIC)和最小殺菌濃度(MBC)分別為:大腸桿菌為2.5 mg/mL和10.0 mg/mL,沙門(mén)氏菌為5.0 mg/mL和15.0 mg/mL,金黃色葡萄球菌為3.5 mg/mL和12.5 mg/mL。卵轉(zhuǎn)鐵蛋白對(duì)大腸桿菌、沙門(mén)氏菌、金黃色葡萄球菌的抑菌效果

8、隨鐵飽和度的增加而降低,相對(duì)于其它金屬結(jié)合鐵時(shí)卵轉(zhuǎn)鐵蛋白的抑菌效果較好。
　　 卵轉(zhuǎn)鐵蛋白能夠提高機(jī)體免疫能力,增強(qiáng)機(jī)體抗病防病的能力,同時(shí)對(duì)預(yù)防貧血等具有很重要的意義。母乳喂養(yǎng)的嬰兒對(duì)腸道細(xì)菌的抵抗能力比奶粉喂養(yǎng)的要強(qiáng),某種程度上是由于母乳中含有較多的乳鐵蛋白。由于卵轉(zhuǎn)鐵蛋白和乳鐵蛋白具有相似的結(jié)構(gòu)和功能,并且臨床證實(shí)嬰兒服用后并無(wú)異源蛋白常有的過(guò)敏等不良反應(yīng)(Francesco Giansanti et al,2001)。卵