HPSH_05790真核表達質(zhì)粒的構建及其生物學效應的初步觀察.pdf

1、幽門螺桿菌(H.pylori)是慢性胃炎和消化性潰瘍的重要病原菌,且與胃癌的發(fā)生密切相關?，F(xiàn)已有許多研究致力于探討H.prlori致病相關的細菌、宿主和環(huán)境因素之間的交互作用。其中,鑒定病原菌的毒力株和毒力蛋白是微生物致病機理研究的基本策略。Enroth等采用2-DE和免疫印跡技術對來自胃炎、十二指腸潰瘍和胃癌患者的不同H.pylori臨床分離株進行蛋白質(zhì)組學研究,結果提示不同類型胃疾病的H.pylori菌株蛋白質(zhì)組中存在疾病特異性蛋白

2、。
　　 目前研究發(fā)現(xiàn),與H.pylori菌株致病性有關的基因位點主要為細胞毒素相關基因(CagA)及空泡毒素相關基因(VacA)等。國外報道,感染CagA陽性或VacA多念性變異的H.pylori菌株可以提高胃癌發(fā)生風險。除了Caga,VacA外,近年來有學者陸續(xù)報道一些功能未知或尚未鑒定的菌株特異性基因位點也可能與H.pylori相關性胃疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關。前期,該室通過抑制消減雜交(SSH)和斑點雜交的方法建立胃癌相關

3、幽門螺桿菌差異基因文庫,對差異基因進行篩選挑出11個與胃癌相關的高拷貝基因序列,證實了其中HPSH_05790在胃癌患者來源的菌株L301及淺表性胃炎患者來源的菌株B975的基因中存在拷貝差異。目前,該差異基因的具體功能尚不清楚。KEGG數(shù)據(jù)庫報道其蛋白結構域中包含peptidyl-prolyl cis-trans isomerase功能域,即肽基-脯氨酰-順反異構酶(PPIase),其被證實在嗜肺軍團菌中具有毒力因子特征。
　　

4、 本研究通過構建胃癌相關差異基因幽門螺桿菌HPSH_05790真核表達質(zhì)粒,并轉(zhuǎn)染3種胃細胞系AGS、SGC7901、GES-1觀察重組蛋白對細胞的增殖效應和細胞周期的變化。為進一步探索疾病相關H.pylori菌株的致病機制,尋找具有針對性的治療靶點提供實驗工具和研究線索。
　　 材料和方法：
　　 一、細胞系、菌株和質(zhì)粒人胚腎AD293細胞系、胃腺癌AGS細胞系購自ATCC。人胃上皮細胞株GES-1來自北京市腫瘤防治

5、研究所細胞遺傳室。人胃腺癌細胞系SGC-7901和H.pylori菌株及DNA來自中國醫(yī)科大學腫瘤研究所腫瘤病因與篩查研究室。DH5a感受態(tài)細菌購自TaKaRa公司。pcDNATM3.1/myc-His(-)質(zhì)粒:由美國西弗吉尼亞大學醫(yī)學院生理/藥理學系劉軍副教授贈與。
　　 二、實驗方法
　　 (一)HPSH_05790基因真核表達質(zhì)粒的構建及其表達產(chǎn)物的鑒定以胃癌及胃炎來源的幽門螺桿菌DNA為模板,根據(jù)差異基因HPS

6、H_05790序列和pcDNATM3.1/myc-His(-)載體多克隆酶切位點設計引物,PCR擴增產(chǎn)物及pcDNATM3.1/myc-His(-)同時用EcoRI、BamHI雙酶切連接后轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH50α,篩選陽性克隆,抽提質(zhì)粒去內(nèi)毒素并測序,與GeneBank中HPSH_05790序列比較同源性。并通過Western Blot方法對表達產(chǎn)物進行鑒定。
　　 (二)細胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染SGC-7901、GES-1、AD293和A

7、GS分別在含有20％胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基、DMEM培養(yǎng)基,F12培養(yǎng)基中培養(yǎng)中培養(yǎng)(37℃,5％CO2)。將各類細胞接種在6孔板里,待細胞密度達到90％左右,用無血清的培養(yǎng)基饑餓2h后,分別轉(zhuǎn)染:以L301、26695菌株為模板構建的HPSH_05790重組質(zhì)粒,以轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒,和未轉(zhuǎn)染的細胞為對照。轉(zhuǎn)染用試劑LipofectamineTM2000,具體操作步驟按說明書進行。取各實驗組及對照組細胞,進行細胞增殖和細胞周期檢測。

8、
　　 (三)細胞增殖和細胞周期檢測
　　 1、CCK-8法檢測細胞增殖能力取轉(zhuǎn)染后的胃癌細胞懸液進行細胞計數(shù),分別接種于3個96孔板培養(yǎng)板。第24、48、72小時分別加入10ulCCK-8溶液,繼續(xù)37℃孵育2-4小時后選擇波長450nm在酶聯(lián)免疫(ELlsA)檢測儀上測定各孔吸光度。
　　 2、流式細胞儀檢測細胞周期變化收集對數(shù)生長期細胞制成5×105個/ml細胞懸液。1000rpm離心5min,棄上清。PB

9、S洗滌一次,棄上清,重新懸浮于75％冰乙醇中,4℃固定過夜、離心后制成400ul的細胞懸液,加碘化丙淀染液(PI)于37℃避光孵育30分鐘后,流式細胞儀檢測,ModFitLT3.0軟件分析細胞周期。
　　 3、統(tǒng)計分析
　　 所有計量資料以均數(shù)±標準差(Mean±SD)描述,每組實驗至少重復3次,采用單因素方差分析。所有統(tǒng)計分析均采用SPSS16.0統(tǒng)計軟件完成,以P＜0.05為有統(tǒng)計學意義。
　　 結果：

10、>　　 1、胃癌相關差異基因HPSH_05790基因真核表達質(zhì)粒的構建及其表達產(chǎn)物的鑒定目的基因PCR、重組質(zhì)粒EcoRI/BamHI雙酶切電泳鑒定,產(chǎn)物為560bpDNA片段,與理論片段大小一致。DNA測序結果表明融合區(qū)域的讀碼框正確。Blast比對序列同源性好。體外轉(zhuǎn)染AD293細胞48h Western Blot結果證實該蛋白可以正常表達。
　　 2、HPSH_05790重組子瞬時轉(zhuǎn)染3種不同胃細胞系,觀察其增殖作用和細

11、胞周期變化情況CCK-8法比較重組蛋白對3個胃細胞系AGS、SGC7901、GES-1增殖作用的影響,發(fā)現(xiàn)在兩個胃癌細胞系AGS、SGC7901中,細胞較正常胃粘膜上皮細胞系有增殖趨勢,尤其是AGS細胞系,但均無統(tǒng)計學意義。觀察3種細胞系瞬時轉(zhuǎn)染后的細胞周期變化,發(fā)現(xiàn)在轉(zhuǎn)染效率較高的AGS細胞系,兩重組蛋白組S期(％)26.927(±2.445),25.683(±2.83)較其他組21.227(±0.813),21.243(±1.71)