牛瑟氏泰勒蟲pVAX1-2p33真核表達質粒的構建及其免疫學初步研究.pdf

1、牛瑟氏泰勒蟲病是由泰勒科、泰勒屬的瑟氏泰勒蟲（Theileria sergenti）寄生于牛的紅細胞內而引起的一種以高熱、貧血、消瘦和體表淋巴結腫大等臨床癥狀的一種血液原蟲病。在我國該病的流行區(qū)域逐年擴大，發(fā)病率和死亡率呈現(xiàn)上升趨勢，對養(yǎng)牛業(yè)的危害較為嚴重，已經(jīng)引起獸醫(yī)界的普遍重視。
　　牛瑟氏泰勒蟲的抗原成分較為復雜，主要有p23、p32、p33表面蛋白等。p33表面蛋白作為一種紅細胞感染階的膜內蛋白，免疫原性較好，在抗牛瑟氏泰

2、勒蟲感染中具有重要作用。
　　本研究根據(jù)已報道的瑟氏泰勒蟲 p33表面蛋白的基因序列，分別設計了兩對特異性的引物，以牛瑟氏泰勒蟲基因組DNA為模版，克隆出兩個大小為723 bp的p33基因。應用SOE-PCR技術獲得大小約為1422 bp的雙拷貝p33基因，并將該雙拷貝p33基因先克隆到pMD18-T-Simple載體，再將其亞克隆到 pVAX1真核表達載體中，構建重組質粒 pVAX1-2p33。對重組質粒pVAX1-2p33采用

3、PCR、酶切及測序的方法進行鑒定后，利用脂質體轉染法將轉染其到BHK-21細胞后進行RT-PCR和IFA鑒定，經(jīng)鑒定正確后，采用質粒大量提取試劑盒大量提取重組質粒 pVAX1-2p33，并將該質粒腿部肌肉注射免疫小鼠，應用間接 ELISA和流式細胞技術對雙拷貝的pVAX1-2p33質粒的免疫效果進行檢測。間接 ELISA試驗結果表明，在相同免疫劑量下，重組質粒pVAX1-2p33免疫組在免疫后的地14 d可刺激免疫小鼠產(chǎn)生特異性抗體，但

4、抗體水平較低，上升趨勢不明顯。但在免疫后的第28 d后抗體呈明顯的上升趨勢，且42 d時到達頂峰，而且pVAX1-2p33免疫組的抗體效價明顯高于pVAX1-p33免疫組(P<0.01)，表明2p33的體液免疫水平顯著高于p33。流式細胞檢測結果表明，重組質粒pVAX1-2p33、pVAX1-p33均能使CD4+、CD8+上升，刺激小鼠產(chǎn)生細胞免疫效果，但二者總體的細胞免疫水平差別不顯著（P>0.05)。
　　本結果將為牛瑟氏泰勒