甲基化EGCG的酶法合成研究.pdf

1、甲基化EGCG是在茶葉中發(fā)現(xiàn)的一種特殊的兒茶素,它在抗過敏等方面表現(xiàn)出了比EGCG更強的藥理作用；EGCG3"Me在動物血液中的穩(wěn)定性明顯高于EGCG,并且口服吸收率也比EGCG高,因而具有較大的藥學(xué)價值和開發(fā)應(yīng)用前景。然而,茶葉中甲基化EGCG(主要是EGCG3"Me)的含量普遍偏低,只有少數(shù)茶樹種質(zhì)中EGCG3"Me的含量在1％以上,這使得直接從茶葉中大量提取EGCG3"Me面臨困難。因此,利用EGCG為原料,通過酶法合成或者化學(xué)合

2、成等方法實現(xiàn)EGCG的甲基化修飾,進而大量制備甲基化EGCG,具有重要的理論意義和應(yīng)用價值。本研究的主要目的是通過重組DNA技術(shù)和發(fā)酵培養(yǎng)技術(shù)來獲得大量的O-甲基轉(zhuǎn)移酶,并利用此酶進行酶促反應(yīng)以獲得甲基化EGCG,以期為今后甲基化EGCG的酶法合成提供理論依據(jù)。主要研究結(jié)果如下:
　　 1.對茶葉O-甲基轉(zhuǎn)移酶在重組大腸桿菌內(nèi)的誘導(dǎo)表達(dá)條件進行了優(yōu)化,結(jié)果表明:誘導(dǎo)劑IPTG終濃度為0.05mmol／L,誘導(dǎo)時間為20h,培養(yǎng)基

3、初始pH為7.0以及誘導(dǎo)溫度為20℃時,誘導(dǎo)表達(dá)的茶葉O-甲基轉(zhuǎn)移酶催化活性最高；并對粗酶液進行了分離純化表明可用50mmol／L的咪唑的緩沖液洗脫雜蛋白,再用200mmol／L的咪唑緩沖液洗脫目的蛋白。
　　 2.酶促反應(yīng)實驗表明:EGCG初始濃度為300μmol／L,緩沖液pH=7.5,反應(yīng)溫度為35℃,Mg2+濃度2mmol／L,二硫蘇糖醇濃度2mmol／L時,甲基化EGCG的產(chǎn)量最高,其中EGCG3"Me為386.39μ

4、g／mL,EGCG4"Me為23.4μg／mL,EGCG3'Me為107.01μg／mL。
　　 3.對EGCG3"Me、EGCG4"Me和EGCG3'Me在正離子條件下的斷裂規(guī)律進行分析,結(jié)果表明甲基化EGCG的斷裂以C環(huán)的Rretro-Diels-Aider(RDA)斷裂為主,并伴隨著B環(huán)和D環(huán)的丟失。
　　 4.根據(jù)甲基化EGCG的斷裂規(guī)律對酶促反應(yīng)產(chǎn)物的質(zhì)譜圖進行分析,結(jié)果表明一共生成了10種甲基化EGCG,其中