ALOX5AP基因啟動(dòng)子區(qū)CpG-SNPs及DNA甲基化與缺血性腦卒中的相關(guān)性研究.pdf

1、研究背景和目的：
　　腦卒中（stroke）又稱腦中風(fēng)，它是由于血管破裂或腦組織供血不足導(dǎo)致出血或血栓的形成，引起腦部出血性或缺血性損傷癥狀為主要臨床表現(xiàn)的一種神經(jīng)系統(tǒng)疾病。我國(guó)屬于腦卒中的高發(fā)國(guó)家，其中缺血性腦卒中（Ischemic stroke，IS）占腦卒中的45.5％～75.9%，并且發(fā)病率呈逐年上升的趨勢(shì)。
　　DeCODE研究小組通過全基因組連鎖分析在冰島人群中首次發(fā)現(xiàn)能引起缺血性腦卒中和心肌梗死發(fā)生的獨(dú)立風(fēng)險(xiǎn)基

2、因—5-脂氧合酶激活蛋白基因（5-lipoxygenase activating protein，ALOX5AP）。ALOX5AP基因定位于13q12-13，編碼合成5-脂氧合酶激活蛋白（FLAP）。FLAP是5-脂氧合酶（5-lipoxyenase，5-LO）的特定激活蛋白，F(xiàn)LAP和5-LO結(jié)合，調(diào)節(jié)炎癥介質(zhì)白三烯（Leukotriene，LT）的生物合成。LT在炎癥疾病的發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮重要作用，可激活白細(xì)胞和單核細(xì)胞，增加血管內(nèi)

3、壁的黏附和通透性等病理機(jī)制，參與動(dòng)脈粥樣硬化的形成。
　　隨著關(guān)聯(lián)研究發(fā)展到全基因組關(guān)聯(lián)分析（Genome-wide association study，GWAS）時(shí)代，目前已經(jīng)在歐洲人群、冰島人群以及日本人群進(jìn)行了IS的GWAS關(guān)聯(lián)研究。但是，GWAS關(guān)聯(lián)研究依然存在種族間的遺傳異質(zhì)性。因此，在后GWAS時(shí)代，應(yīng)該如何進(jìn)行IS的遺傳關(guān)聯(lián)研究面臨重大挑戰(zhàn)。
　　表觀遺傳學(xué)（epigenetics）為研究IS的發(fā)病機(jī)制提供了新

4、的視角和思路。表觀遺傳學(xué)是基于不改變DNA序列的基礎(chǔ)上，可遺傳的基因表達(dá)的改變。DNA甲基化是表觀遺傳學(xué)基因表達(dá)調(diào)控的一種重要機(jī)制，它是以甲基轉(zhuǎn)移酶（DNA methyltransferase，DNMT）催化介導(dǎo)，以S-腺苷甲硫氨酸（S-adenosylmethionine，SAM）為供體，將CpG二核苷酸胞嘧啶環(huán)上5號(hào)碳原子的-H被-CH3取代，形成5-甲基胞嘧啶（5mC）。近年來(lái)，DNA甲基化的改變導(dǎo)致基因表達(dá)的異常在IS發(fā)病中的作

5、用成為新的研究熱點(diǎn)。然而，ALOX5AP基因啟動(dòng)子區(qū)DNA甲基化與IS的相關(guān)性研究目前尚未見報(bào)道。
　　最新研究表明，位于基因啟動(dòng)子區(qū)CpG島上的SNPs，即CpG-SNPs，該SNP恰好可以增加或去除相應(yīng)的CpG位點(diǎn)，進(jìn)而影響DNA的甲基化水平，導(dǎo)致等位基因特異的甲基化（Allele-specific DNA methylation，ASM）現(xiàn)象。因此，CpG-SNPs被認(rèn)為具有調(diào)節(jié)遺傳（SNP）與表觀遺傳（DNA甲基化）的交互

6、作用，進(jìn)而影響基因表達(dá)功能的潛在機(jī)制。目前，關(guān)于ALOX5AP基因CpG-SNPs及其與DNA甲基化的互作方面的研究尚未見報(bào)道。
　　因此，本課題提出如下假說(shuō)：ALOX5AP基因啟動(dòng)子區(qū)的CpG-SNPs可能通過等位基因特異的甲基化（ASM）調(diào)控基因的表達(dá)，進(jìn)而影響IS的遺傳易感性。本研究將從遺傳、表觀遺傳及其交互作用的新角度揭示IS的發(fā)病機(jī)制及其特點(diǎn)，為IS的病理學(xué)機(jī)制以及人群防治提供理論依據(jù)。
　　研究對(duì)象：
　　

7、1.1.IS患者的選取
　　隨機(jī)選取在鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院和鄭州市第一人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科自2015年3月至2016年3月住院的IS患者。
　　初始人群：IS患者40例，其中男性26例，女性14例，平均年齡61.1±13.3歲。
　　驗(yàn)證人群：IS患者90例，其中男性51例，女性39例，平均年齡60.5±12.5歲。
　　IS的診斷均符合中華醫(yī)學(xué)會(huì)第四屆修訂的缺血性腦卒中的診斷標(biāo)準(zhǔn)，并經(jīng)臨床檢查（體征、生化檢驗(yàn)、病史

8、、CT/MRI）確診。
　　1.2.正常對(duì)照個(gè)體的選取
　　隨機(jī)選取與IS組同期體檢的、性別和年齡相匹配的、且無(wú)腦出血、栓塞性腦梗死等腦血管病史的個(gè)體作為對(duì)照組。
　　初始人群：對(duì)照組40例，其中男性18例，女性22例，平均年齡57.9±14.1歲。
　　驗(yàn)證人群：對(duì)照組96例，其中男性42例，女性54例，平均年齡62.5±13.2歲。
　　所有參與個(gè)體均為河南漢族且無(wú)血緣關(guān)系的人群。本研究獲得鄭州大學(xué)倫理

9、委員會(huì)的批準(zhǔn)，所有參與個(gè)體均簽署知情同意書。
　　研究方法：
　　運(yùn)用天根公司全血基因組提取試劑盒提取外周血基因組DNA和RNA，進(jìn)行RNA反轉(zhuǎn)錄。首先，運(yùn)用實(shí)時(shí)定量RT-PCR技術(shù)檢測(cè)IS組與正常對(duì)照組外周血中ALOX5AP基因mRNA的表達(dá)水平；然后，應(yīng)用重亞硫酸鹽測(cè)序PCR（Bisulfite sequencing PCR，BSP）技術(shù)檢測(cè)ALOX5AP基因啟動(dòng)子DNA甲基化水平；其次，選取ALOX5AP基因啟動(dòng)子區(qū)C

10、pG島上rs370679485、rs74043542、rs146576796、rs4073259、rs116205889、rs115053311等6個(gè)SNPs位點(diǎn)，采用Sanger測(cè)序技術(shù)進(jìn)行基因分型；最后，對(duì)陽(yáng)性關(guān)聯(lián)CpG-SNP位點(diǎn)rs4073259采用SNaPshot技術(shù)擴(kuò)大樣本進(jìn)行驗(yàn)證。
　　本研究實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理。IS組與對(duì)照組間的定量資料采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)和單因素方差分析，所有數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)

11、準(zhǔn)差（mean±SD）表示，對(duì)各組間的等位基因頻率和基因型頻率的差異進(jìn)行χ2檢驗(yàn)。采用SHEsis軟件進(jìn)行Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗(yàn)。以相對(duì)風(fēng)險(xiǎn)度（Odds Ratio，OR）及95%可信區(qū)間（CI）表示對(duì)疾病發(fā)生的相對(duì)危險(xiǎn)度，檢驗(yàn)水準(zhǔn)為α=0.05。P<0.05具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。運(yùn)用Bivariate相關(guān)性分析方法，對(duì)IS組中的ALOX5AP基因啟動(dòng)子區(qū)的平均甲基化水平與其mRNA表達(dá)水平進(jìn)行相關(guān)性分析。
　　結(jié)果：

12、
　　1. IS組ALOX5AP基因的mRNA表達(dá)水平（2.23±0.31）顯著高于對(duì)照組（1.03±0.25），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。
　　2.檢測(cè)ALOX5AP基因啟動(dòng)子區(qū)17個(gè)CpG位點(diǎn)，IS組ALOX5AP基因啟動(dòng)子區(qū)的DNA甲基化水平顯著高于對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；性別分層分析發(fā)現(xiàn)，男性IS組的甲基化水平亦顯著高于男性對(duì)照組（P<0.05）。
　　3. ALOX5AP基因啟動(dòng)

13、子區(qū)甲基化水平與mRNA表達(dá)水平呈顯著正相關(guān)（r=0.341，P=0.031）。
　　4.攜帶ALOX5AP基因CpG-SNP rs4073259位點(diǎn)的GG基因型和G等位基因的個(gè)體降低發(fā)生IS的風(fēng)險(xiǎn)（P=0.038，OR=0.415，95%CI：0.179-0.960；P=0.043，OR=0.656，95%CI：0.435~0.988）。且在隱性遺傳模式中，GG基因型降低IS的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)（P=0.039，OR=0.471，95%C

14、I：0.228~0.979）。
　　5.對(duì)CpG-SNP rs4073259位點(diǎn)AA、AG、GG基因型個(gè)體在CpG8的平均甲基化水平進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)GG基因型個(gè)體的甲基化水平顯著性高于AA基因型的個(gè)體，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。而GG基因型個(gè)體的mRNA表達(dá)水平顯著低于AG、AA基因型的個(gè)體，差異亦具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。
　　結(jié)論：
　　1.促炎基因ALOX5AP的過表達(dá)可能通過參與動(dòng)脈壁的炎癥反應(yīng)介

15、導(dǎo)IS的發(fā)生。
　　2. ALOX5AP基因啟動(dòng)子區(qū)的高甲基化與IS的發(fā)生密切相關(guān)，且呈現(xiàn)性別差異。
　　3. ALOX5AP基因啟動(dòng)子區(qū)CpG-SNP rs4073259位點(diǎn)對(duì)IS的發(fā)生具有保護(hù)作用，攜帶GG基因型及G等位基因的個(gè)體發(fā)生IS的風(fēng)險(xiǎn)降低。
　　4. ALOX5AP基因CpG-SNP rs4073259位點(diǎn) G等位基因的特異性甲基化（ASM）抑制ALOX5AP基因mRNA的表達(dá)，進(jìn)而影響IS的遺傳易感性。