HCC及血液系統(tǒng)惡性腫瘤中DNA甲基化腫瘤標(biāo)志物研究.pdf

1、腫瘤標(biāo)志物以無(wú)創(chuàng)性和簡(jiǎn)便的優(yōu)點(diǎn)成為腫瘤早期診斷和病情監(jiān)測(cè)的重要指標(biāo)。表觀遺傳學(xué)興起為從該角度推動(dòng)腫瘤分子標(biāo)志物發(fā)展提供了可能。DNA甲基化是表觀遺傳學(xué)三個(gè)組成部分之一，也是迄今為止研究最為成熟的一部分。DNA甲基化在腫瘤細(xì)胞中的具體表現(xiàn)為腫瘤細(xì)胞基因組整體的甲基化水平降低和特定基因5'端區(qū)域異常的甲基化改變兩類。以特定基因5'端CpG位點(diǎn)甲基化模式改變來早期診斷和描述腫瘤已有較多報(bào)道。 本課題首先把這一領(lǐng)域的先進(jìn)理論和方法學(xué)進(jìn)展

2、引進(jìn)到研究具有我國(guó)地域特色的惡性腫瘤——原發(fā)性肝細(xì)胞癌(HCC)的研究中，試圖通過分析大多數(shù)腫瘤細(xì)胞表達(dá)而正常細(xì)胞不表達(dá)的腫瘤－精細(xì)胞系(CT)抗原家族的黑色素瘤抗原(MAGE)基因家族，把MAGE-A基因家族5'端CpG位點(diǎn)甲基化模式的改變作為HCC的新腫瘤標(biāo)志物。在試驗(yàn)中，用亞硫酸氫鹽修飾測(cè)序PCP(BSP)方法，直接把PCR產(chǎn)物測(cè)序，檢查HepG2、BEL7402、BEL7404和BEL7407四種HCC細(xì)胞株和外周血白細(xì)胞(WB

3、C)正常對(duì)照的甲基化模式的差異，尋找HCC特異的MAGE-A甲基化模式。根據(jù)HCC特異甲基化模式設(shè)計(jì)甲基化特異PCR(MSP)檢測(cè)引物，建立區(qū)分HCC和正常對(duì)照的MSP，檢測(cè)HCC和各種對(duì)照的病理切片和外周血漿游離DNA。 通過對(duì)肝癌細(xì)胞株的研究表明，在七個(gè)MAGE-A亞型中，MAGE-A1和MAGE-A3的5'端CpG位點(diǎn)甲基化模式表現(xiàn)出與正常對(duì)照明顯不同，由此設(shè)計(jì)的MSP檢測(cè)HCC病人和非HCC對(duì)照中，石蠟包埋病理切片標(biāo)本和

4、外周血漿DNA，檢測(cè)HCC的靈敏度分別是91.2％和61.5％，而特異度均可達(dá)到100％。為使用DNA甲基化腫瘤標(biāo)志物診斷HCC提供了直接的證據(jù)。 HCC中MAGE基因的異常甲基化研究，既直接證明了發(fā)展DNA甲基化腫瘤標(biāo)志物的可能性，也建立了本實(shí)驗(yàn)室研究DNA甲基化的方法學(xué)平臺(tái)。不過，隨著研究的深入，DNA甲基化腫瘤標(biāo)志物研究中存在的一些問題也表現(xiàn)出來，突出體現(xiàn)在各文獻(xiàn)報(bào)道中，同樣的基因相似甲基化位點(diǎn)，在同樣類型腫瘤標(biāo)本中，甲基

5、化檢測(cè)的陽(yáng)性率不一致，差別很大。這一問題不能得到澄清，必將成為發(fā)展DNA甲基化腫瘤標(biāo)志物的主要障礙。我們推測(cè)關(guān)鍵原因有兩點(diǎn)：(一)缺少對(duì)CpG位點(diǎn)全面甲基化狀態(tài)分析，以局部代表總體，導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果不一致；(二)缺乏大樣本驗(yàn)證。對(duì)這兩個(gè)問題的求證使本研究的方向轉(zhuǎn)向了對(duì)血液系統(tǒng)惡性腫瘤這一亞型眾多的腫瘤的研究，構(gòu)成了本研究的第二章節(jié)的內(nèi)容。 本課題對(duì)正常對(duì)照WBC細(xì)胞和HL-60、K562、Jurkat及U937等四種不同類型的血液系

6、統(tǒng)疾病細(xì)胞株，用BSP方法，全長(zhǎng)克隆測(cè)序P15、P73、O6MGMT、DAP-K、HIC1和CDH1等六個(gè)常見血液系統(tǒng)惡性腫瘤抑癌基因CpG島區(qū)域。根據(jù)各BSP產(chǎn)物的多個(gè)克隆測(cè)序結(jié)果，繪制各型細(xì)胞基因組六個(gè)基因詳細(xì)的甲基化狀態(tài)頻率圖譜。分析該圖譜，可見CpG位點(diǎn)區(qū)分為完全甲基化、完全去甲基化和部分甲基化三部分。顯示了各細(xì)胞基因組特定甲基化模式，找到一系列各型血液系統(tǒng)惡性腫瘤細(xì)胞株特異性甲基化改變位點(diǎn)。選擇出了可以作為區(qū)分這五種類型細(xì)胞的

7、特異性DNA甲基化位點(diǎn)組合，也即這五種不同基因組代表的正常和四種類型血液病的，潛在的特異性DNA甲基化CpG位點(diǎn)庫(kù)，作為進(jìn)一步篩選DNA甲基化腫瘤標(biāo)志物基礎(chǔ)。該部分的初步完成，顯示了特定基因DNA甲基化特異性改變?cè)\斷多種復(fù)雜腫瘤類型的能力，也顯示了各種腫瘤中各基因甲基化狀態(tài)的復(fù)雜性，提示了篩選DNA甲基化腫瘤標(biāo)志物是一個(gè)需要反復(fù)篩查和驗(yàn)證的大工程。同時(shí)，為下一步通過大量臨床標(biāo)本驗(yàn)證DNA甲基化模式作為腫瘤標(biāo)志物的效能提供大量的候選CpG