惡性腫瘤個(gè)體化治療相關(guān)生物標(biāo)志物的篩選研究.pdf

1、惡性腫瘤是威脅人類健康的常見(jiàn)疾病,位居人類疾病三大主要死亡原因之首,占所有疾病死因的四分之一。多年來(lái),惡性腫瘤的治療手段保持著以手術(shù)為主輔以全身的化療和局部放療的綜合治療模式；近年來(lái),腫瘤學(xué)家認(rèn)識(shí)到由于個(gè)體腫瘤的生物遺傳異質(zhì)性以及個(gè)體間的遺傳差異性決定了不同患者對(duì)同一腫瘤治療方案表現(xiàn)不同的反應(yīng)性。對(duì)這些差異的理解使我們?cè)谀[瘤治療策略上產(chǎn)生革命性的變化即腫瘤的個(gè)體化治療,腫瘤個(gè)體化治療是對(duì)每一個(gè)腫瘤患者“量體裁衣”,根據(jù)每個(gè)個(gè)體腫瘤生物學(xué)

2、特征以及基因組學(xué)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)上的差異進(jìn)行針對(duì)性的治療,使療效最大化和毒性最低化。
　　 惡性腫瘤藥物治療包括化學(xué)治療和靶向治療。傳統(tǒng)的腫瘤化學(xué)治療存在治療的靶向不明確、選擇性不強(qiáng)和易產(chǎn)生耐藥等特點(diǎn),導(dǎo)致其有效率低和在殺傷腫瘤細(xì)胞的同時(shí)損害正常組織細(xì)胞等缺點(diǎn),然而如何實(shí)現(xiàn)傳統(tǒng)化療對(duì)腫瘤患者的個(gè)體化治療是目前腫瘤學(xué)家需要深入研究的問(wèn)題,目前在一些惡性腫瘤的化療中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)一些基因的多態(tài)性和表達(dá)狀況與某些化療藥物的療效以及副反應(yīng)有一定的相

3、關(guān)性,可以用來(lái)指導(dǎo)化療藥物的選擇。
　　 隨著對(duì)腫瘤發(fā)生發(fā)展分子機(jī)制認(rèn)識(shí)的不斷深入和分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展,針對(duì)腫瘤細(xì)胞受體、信號(hào)傳導(dǎo)和血管生成等關(guān)鍵分子的分子靶向治療已成為腫瘤藥物治療領(lǐng)域的一個(gè)新的方向,是腫瘤個(gè)體化治療理念的一個(gè)重要典范。靶向治療是指抗腫瘤藥物靶向性地與腫瘤的不同特性靶標(biāo)位點(diǎn)發(fā)生作用而殺死腫瘤細(xì)胞,靶向治療對(duì)正常組織影響較小,是目前最理想的腫瘤治療模式。
　　 因此在本研究中,我們以我國(guó)常見(jiàn)的兩種惡性腫

4、瘤,結(jié)直腸癌和肺癌為例,應(yīng)用表面加強(qiáng)激光解吸電離-飛行時(shí)間質(zhì)譜(Surface Enhanced LaserDesorption／Ionization Time-of-Flight Mass Spectrometry,SELDI—TOF—MS)蛋白質(zhì)指紋圖譜分析技術(shù),在血清中尋找可以預(yù)測(cè)兩種腫瘤常用化療藥物療效的蛋白標(biāo)志物；在結(jié)直腸癌組織標(biāo)本中,應(yīng)用焦磷酸鹽測(cè)序法分析抗EGFR單克隆抗體靶向治療分子標(biāo)志K-ras基因的突變狀況及其與臨床

5、病理因素的相關(guān)性。
　　 第一部分晚期結(jié)直腸癌化療療效預(yù)測(cè)的血清蛋白質(zhì)指紋圖譜模型的初步研究。
　　 1、應(yīng)用SELDI-TOF-MS蛋白質(zhì)學(xué)技術(shù),分析晚期結(jié)直腸癌患者42例化療受益者與28例無(wú)效者血清蛋白質(zhì)指紋圖譜差異,篩選出10個(gè)蛋白質(zhì)峰(質(zhì)荷比為9286m／z、9431m／z、9375m／z、9298m／z、4304m／z,9352m／z,9404m／z,4606m／z,9198m／z,3963m／z)組合所構(gòu)建而

6、成的結(jié)直腸癌化療療效預(yù)測(cè)模型,其總準(zhǔn)確率為90.0％(63／70),靈敏度為90.7％(39／43),特異度為88.9％(24／27)。這些蛋白質(zhì)峰均在化療受益組表達(dá)高于化療無(wú)效組。
　　 2、應(yīng)用SELDI-TOF—MS蛋白質(zhì)學(xué)技術(shù),分析29例接受FOLFOX化療方案受益者與15例無(wú)效者血清蛋白質(zhì)指紋圖譜差異,篩選出6個(gè)蛋白質(zhì)峰(質(zhì)荷比為9298m／z、9282m／z、4606m／z、9198m／z、7775m／z,2266m

7、／z)組合所構(gòu)建而成的FOLFOX方案化療的化療療效預(yù)測(cè)模型總準(zhǔn)確率為88.6％(39144),靈敏度為92.9％(26／28),特異度為81.3％(13／16)。其中2266m／z這個(gè)峰在化療受益者中低表達(dá)；9298 m／z、9281 m／z、4606m／z、9198m／z、7775m／z這5個(gè)峰在化療受益者中高表達(dá)。
　　 3、應(yīng)用SELDI-TOF-MS蛋白質(zhì)學(xué)技術(shù),分析13例接受FOLFIRI方案化療受益者與13例無(wú)效者

8、血清蛋白質(zhì)指紋圖譜差異,篩選出7個(gè)蛋白質(zhì)峰(質(zhì)荷比為4321m／z、4305m／z、2648m／z、2952m／z、4121m／z,4292m／z,3980 m／z)組合所構(gòu)建而成的結(jié)直腸癌FOLFIRI方案化療的療效預(yù)測(cè)模型總準(zhǔn)確率為92.3％(24／26),靈敏度為92.3％(12／13),特異性為92.3％(12／13)。其中2648m／z,2952m／z,4121m／z這3個(gè)峰在化療受益者中低表達(dá),4321 m／z、4305m／

9、z、4292 m／z、3980m／z這3個(gè)峰在化療受益者中高表達(dá)。
　　 第二部分晚期非小細(xì)胞肺癌化療療效預(yù)測(cè)的血清蛋白質(zhì)指紋圖譜模型的初步研究。
　　 通過(guò)對(duì)晚期非小細(xì)胞肺癌患者中35例化療受益者與12例無(wú)效者血清蛋白質(zhì)質(zhì)譜數(shù)據(jù)的比較,共檢測(cè)到表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)的蛋白質(zhì)峰11個(gè)。通過(guò)交叉驗(yàn)證,判別分析軟件篩選出8個(gè)蛋白質(zhì)峰(質(zhì)荷比為4353m／z、2970m／z、2957m／z、4292m／z、394

10、3m／z,2961m／z,4121m／z,2000m／z)組合所構(gòu)建而成的NSCLC化療療效預(yù)測(cè)模型的準(zhǔn)確率為95.7％。其中4353m／z、2970 m／z、2957 m／z、4292 m／z、3943 m／z、2961 m／z、4121 m／z這7個(gè)峰在晚期非小細(xì)胞肺癌患者化療受益者血清中表達(dá)高于無(wú)效者；2000m／z這個(gè)峰在非小細(xì)胞肺癌患者化療受益者血清中表達(dá)低于無(wú)效者。
　　 第三部分 K-ras和BRAF基因突變及其與

11、結(jié)直腸癌臨床病理因素的關(guān)系研究。
　　 選取118例均經(jīng)病理證實(shí)的結(jié)直腸癌腫瘤組織標(biāo)本。焦磷酸鹽測(cè)序法檢測(cè)K-ras基因第1外顯子第12、13和61密碼子以及BRAF基因第600密碼子突變狀況,并分析K—ras基因突變與病人年齡、腫瘤部位、分化程度、臨床分期、pT及pN以及預(yù)后的相關(guān)性。
　　 1、在40例結(jié)直腸癌標(biāo)本中,分別應(yīng)用PCR-直接測(cè)序法和焦磷酸鹽測(cè)序法檢測(cè)K-ras基因第1外顯子第12和13密碼子突變,比較兩

12、種方法的檢出率、靈敏度,40例結(jié)直腸癌患者的腫瘤組織經(jīng)常規(guī)PCR擴(kuò)增后直接測(cè)序無(wú)一例發(fā)現(xiàn)K-ras基因第12、13密碼子的突變；經(jīng)焦磷酸測(cè)序法檢測(cè)發(fā)現(xiàn),11例含有K-ras基因第12密碼子突變,2例含有K-ras基因第13密碼子突變,總突變檢測(cè)率32.5％(13／40)。
　　 2、118例結(jié)直腸癌組織標(biāo)本經(jīng)焦磷酸鹽測(cè)序法檢測(cè)共發(fā)現(xiàn)突變41例,突變率為34.7％(41／118),其中第12密碼子突變28例,突變率為23.7％(2

13、8／118)；第13密碼子突變12例,突變率為10.2％(12／118)；第61密碼子突變僅1例(0.8％,1／118)；僅有2個(gè)患者被檢測(cè)到15外顯子的第600密碼子的BRAF基因突變。
　　 3、K—ras突變與性別存在顯著的相關(guān)性,女性結(jié)直腸癌病人組織中K-ras基因突變明顯高于男性(44.7％vs28.2％,P=0.037),女性直腸癌患者組織中K-ras基因突變率高于男性(34.O％vs11.2％,P<0.05),而男

14、性結(jié)腸癌患者組織中K-ras基因突變率則高于女性(16.9％vs10.6％,P<0.05)。
　　 4、野生型K-ras結(jié)直腸癌患者的中位生存時(shí)間為84.0個(gè)月,較突變型K-ras患者的中位生存期(63.0月)要稍高,然而差異不顯著(P=0.25)；K-ras第12、13密碼子突變患者的中位生存期分別為45.0月和63.0月；而第61密碼子突變患者的中位生存期則較長(zhǎng),為73.0月,然而沒(méi)有數(shù)據(jù)表明K-ras基因第12、13和61

15、密碼子突變與患者生存期之間存在顯著的相關(guān)性。
　　 結(jié)論：
　　 1、10個(gè)蛋白質(zhì)峰(質(zhì)荷比為9286m／z、9431m／z、9375m／z、9298m／z、4304m／z,9352m／z,9404m／Z,4606m／z,9198m,z,3963m／z)組合所構(gòu)建而成的模型可以預(yù)測(cè)晚期結(jié)直腸癌化療療效,其準(zhǔn)確率為90.0％；
　　 2、6個(gè)蛋白質(zhì)峰(質(zhì)荷比為9298m／z、9282m／z、4606m／z、9198

16、m／z、7775m／z,2266m／z)組合所構(gòu)建而成的模型可以預(yù)測(cè)晚期結(jié)直腸癌FOLFOX方案的化療；
　　 療效,準(zhǔn)確率為88.6％；
　　 3、7個(gè)蛋白質(zhì)峰(質(zhì)荷比為4321m／z、4305m／z、2648m／z、2952m／z、4121m／z,4292m／z,3980 m／z)組合所構(gòu)建而成的模型可以預(yù)測(cè)晚期結(jié)直腸癌FOLFIRI化療方案的療效,準(zhǔn)確率為92.3％；
　　 4、8個(gè)蛋白質(zhì)峰(質(zhì)荷比為435

17、3m／z、2970m／z、2957m／z、4292m／z、3943m／z,2961m／z,4121m／z,2000m／z)組合所構(gòu)建而成的晚期NSCLC化療療效預(yù)測(cè)模型的準(zhǔn)確率為95.7％；
　　 5、與目前臨床基因突變檢測(cè)的經(jīng)典方法-PCR產(chǎn)物直接測(cè)序方法相比,焦磷酸鹽測(cè)序法能快捷、靈敏地檢測(cè)出結(jié)直腸癌組織中K-ras基因的突變,可作為K-ras；
　　 基因臨床常規(guī)突變檢測(cè)方法推廣；
　　 6、在中國(guó)人群中,