球孢白僵菌的退化與DNA甲基化關(guān)系的初步研究.pdf

1、球孢白僵菌Beauveria bassiana（以下簡(jiǎn)稱白僵菌）具有侵染力強(qiáng)、分布廣以及流行快的特點(diǎn)；同時(shí)也具有易于培養(yǎng)，不污染環(huán)境等優(yōu)勢(shì)。因此，作為重要的昆蟲(chóng)病原真菌，白僵菌目前已廣泛應(yīng)用于農(nóng)林業(yè)害蟲(chóng)生物防治。然而，在實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)和工業(yè)生產(chǎn)過(guò)程中，白僵菌也普遍存在著菌體退化問(wèn)題。白僵菌菌體退化對(duì)于其發(fā)酵生產(chǎn)及殺蟲(chóng)效果有著直接的負(fù)面影響。研究表明，DNA甲基化修飾普遍存在于生物生命過(guò)程中。它通過(guò)調(diào)節(jié)基因表達(dá)使生物體在生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中產(chǎn)生出不

2、同的性狀。因此，揭示球孢白僵菌在培養(yǎng)過(guò)程中菌體退化與其DNA甲基化的關(guān)系，可以為今后進(jìn)一步研究白僵菌表觀遺傳學(xué)以及DNA甲基化在菌體生長(zhǎng)發(fā)育機(jī)制中的具體功能提供基礎(chǔ)材料和科學(xué)依據(jù)，同時(shí)也將為白僵菌的規(guī)模化發(fā)酵與產(chǎn)業(yè)化奠定更加堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)。
　　本研究采用RACE技術(shù)克隆出球孢白僵菌DNA甲基轉(zhuǎn)移酶編碼基因Dim-2全序列，并通過(guò)生物信息學(xué)方法，對(duì)該蛋白進(jìn)行了同源序列比對(duì)與系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)分析。同時(shí)，本研究還利用Realtime-PCR

3、技術(shù)和HPLC技術(shù)對(duì)球孢白僵菌在生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中Dim-2基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)以及基因組DNA中5-甲基胞嘧啶的含量進(jìn)行了檢測(cè)，分析了球孢白僵菌生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中DNA甲基化的變化情況。
　　序列分析表明，球孢白僵菌Dim-2基因cDNA序列全長(zhǎng)為4021bp，編碼了1142個(gè)氨基酸。其5’非翻譯區(qū)（5’-UTR）與3’非翻譯區(qū)（3’-UTR）分別為283個(gè)核苷酸和303個(gè)核苷酸。預(yù)測(cè)的白僵菌DIM-2編碼蛋白分子量為128kD，理論等電點(diǎn)6

4、.13。利用NCBI提供的蛋白保守區(qū)數(shù)據(jù)庫(kù)（CDD）平臺(tái)對(duì)球孢白僵菌Dim-2基因編碼蛋白保守結(jié)構(gòu)域進(jìn)行預(yù)測(cè)。結(jié)果顯示，該蛋白含有能催化合成5-甲基胞嘧啶的活性區(qū)域以及一個(gè)BAH結(jié)構(gòu)域。蛋白多序列比對(duì)與進(jìn)化樹(shù)分析顯示，球孢白僵菌Dim-2基因編碼蛋白與GenBank中已登錄注釋的蛹蟲(chóng)草(Cordyceps militaris)、輪枝菌（Verticillium alboatrum）、粗糙脈孢霉（Neurospora crassa）、巴西

5、芽生菌(Paracoccidioides brasiliensis)等11種真菌的DNA甲基轉(zhuǎn)移酶具有高度同源性。包括白僵菌DIM-2編碼蛋白在內(nèi)的12種真菌DNA甲基轉(zhuǎn)移酶氨基酸序列共聚成兩個(gè)群。其中與球孢白僵菌Dim-2基因編碼蛋白關(guān)系最近的蛹蟲(chóng)草DIM-2蛋白，二者一致性達(dá)到了63％。
　　將本實(shí)驗(yàn)室保存的球孢白僵菌Bb2005單孢株點(diǎn)接于SDAY培養(yǎng)基中，25℃下每十天傳代培養(yǎng)一次，并觀察菌體生長(zhǎng)與產(chǎn)孢情況。菌落形態(tài)學(xué)檢測(cè)

6、發(fā)現(xiàn)，在1~3代時(shí)，白僵菌Bb2005菌落呈規(guī)則的圓形，5天后開(kāi)始產(chǎn)孢，第7天形成大量孢子；而第4代培養(yǎng)時(shí)，菌體開(kāi)始出現(xiàn)不規(guī)則的扇形角變區(qū)域，且產(chǎn)孢變少；培養(yǎng)至第10代時(shí)出現(xiàn)菌絲生長(zhǎng)旺盛，產(chǎn)孢明顯減少的狀態(tài)；而培養(yǎng)至第25代時(shí)白僵菌Bb2005已完全退化，菌絲瘋長(zhǎng)且很少產(chǎn)孢。
　　利用Realtime-PCR與HPLC技術(shù)分別對(duì)第1代、第25代和復(fù)壯后的球孢白僵菌Bb2005菌株在第3、5、7、10、15天培養(yǎng)時(shí)的Dim-2基因轉(zhuǎn)

7、錄表達(dá)量和基因組DNA的5-甲基胞嘧啶百分含量進(jìn)行檢測(cè)。檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，白僵菌Bb2005菌株不同代數(shù)與不同生長(zhǎng)階段，其DNA甲基轉(zhuǎn)移酶的表達(dá)與DNA甲基化程度均有差異。球孢白僵菌DNA甲基化程度會(huì)隨著其生長(zhǎng)發(fā)育的變化而不斷改變，并且DNA甲基化與球孢白僵菌Dim-2的表達(dá)具有一定的相關(guān)性。結(jié)果還顯示，球孢白僵菌Dim-2基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)量與基因組DNA的5-甲基胞嘧啶百分含量在菌體生長(zhǎng)過(guò)程中，均呈現(xiàn)兩邊高中間低的趨勢(shì)。在菌體培養(yǎng)初始產(chǎn)孢階段，