單一畸形精子癥患者精子印記基因DNA甲基化與DNA損傷的初步研究.pdf

1、不育癥,是人類現(xiàn)今面臨的重大健康問題之一,影響了10-15％的育齡夫婦,其中男性因素占了大約50%。在臨床上,男性因素不育通常是根據(jù)異常的精子參數(shù)(如少精、弱精、畸形精子等)來診斷的。精子作為配子之一,關(guān)乎著人類的繁衍生息。據(jù)報(bào)道,70%的男性不育癥患者由精液或者精子異常導(dǎo)致。諸多研究顯示,與精液的其他參數(shù)(濃度、活力、存活率等)相比,精子形態(tài)對胚胎受精潛能和臨床妊娠結(jié)局具有更好的預(yù)測價(jià)值,這一結(jié)論在體內(nèi)和體外試驗(yàn)中均得到了驗(yàn)證。正是由

2、于精子形態(tài)的重要預(yù)測價(jià)值和目前男性精液質(zhì)量日益下降的現(xiàn)狀,近年來,WHO關(guān)于畸形精子癥患者的鑒定閾值一直在更新,正常精子形態(tài)百分比由1978年的50%,到1992年的30%,到1999年的15%,尤其是2010年頒布的第五版精液分析標(biāo)準(zhǔn),將這一閾值定為4%,從而引發(fā)了國內(nèi)外生殖學(xué)家的廣泛關(guān)注和爭議。但目前的研究,絕大部分是關(guān)于精子形態(tài)與輔助生殖技術(shù)后的周期結(jié)局的相關(guān)性分析,而鮮有進(jìn)一步的機(jī)制分析。印記基因是指親本僅一方來源的同源基因表達(dá)

3、,而另一方來源的不表達(dá)。這種差異表達(dá)由DNA序列上印記基因控制區(qū)域的共價(jià)修飾來調(diào)控,主要參與了胚胎的正常生長、發(fā)育及小兒的行為發(fā)展。而精子DNA損傷情況與胚胎發(fā)育、臨床妊娠和流產(chǎn)等均密切相關(guān)。因此,本研究以單一畸形精子癥為研究對象,從與臨床妊娠結(jié)局相關(guān)性、DNA甲基化修飾和DNA完整性三個(gè)方面進(jìn)行研究。
　　目的:
　　回顧性分析單一畸形精子癥與臨床妊娠結(jié)局是否存在相關(guān)性;檢測精子印記基因(父源H19、母源SNRPN以及Li

4、ne-1)DNA甲基化改變和精子細(xì)胞凋亡。
　　方法:
　　本研究以唐都醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心2012年4月-2013年5月期間,因單一畸精癥原因接受輔助受孕治療的患者夫婦為研究對象,首先回顧性分析了精子形態(tài)與臨床妊娠結(jié)局的相關(guān)性;進(jìn)一步挑選了40例單一畸形精子癥患者精液樣本,通過Isolate法離心洗滌純化精子后提取DNA,采取亞硫酸氫鹽測序PCR的方法分析父源印記基因H19、母源印記基因SNRPN以及Line-1的DNA甲基化

5、狀態(tài),并且通過流式細(xì)胞術(shù)檢測了其精子凋亡(DNA損傷)情況。
　　結(jié)果:
　　1、行IVF助孕后,對照組的胚胎正常受精率、卵裂率、優(yōu)胚率、臨床妊娠率、流產(chǎn)率分別為83.09%、94.52%、49.58%、62%、5.14%,單一畸形精子癥患者的胚胎正常受精率、卵裂率、優(yōu)胚率、臨床妊娠率、流產(chǎn)率分別為83.64%、95.26%、41.88%、64.41%、6.95%,各項(xiàng)指標(biāo)均無顯著差異(P>0.05);行ICSI助孕后,對照

6、組胚胎正常受精率、卵裂率、優(yōu)胚率、臨床妊娠率分別為86.54%、96.80%、43.08%、56%,單一畸形精子癥患者的對應(yīng)指標(biāo)分別為87.78%、98.13%、41.67%、56.25%,均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05),但單一畸形精子癥患者的流產(chǎn)率卻顯著升高,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(6.19%Vs19.5%,P<0.05)。
　　2、DNA甲基化的結(jié)果:①父源印記基因 H19:畸形精子組的克隆丟失率為36.05±2.86%,CpG島

7、丟失率為3.85±0.41%,CTCF6結(jié)合位點(diǎn)區(qū)域CpG島丟失率為2.43±0.19%,而對照組則分別為13.41±3.21%,0.75±0.17%,0.25±0.06%,差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01);②母源印記基因SNRPN:DNA甲基化改變在畸形精子組與對照組相比,無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05);③基因Line-1:在畸形精子組和對照組均呈現(xiàn)高度甲基化的狀態(tài)(對照組80.54±2.9%Vs畸形精子組79.67±3.2%),且