菜薹雄性不育和抽薹性分子標(biāo)記篩選及定位研究.pdf

1、菜薹(Brassica campestris L.ssp.Chinensis var．utilis Tsen et Lee)又稱菜心，屬于十字花科蕓薹屬蕓薹種白菜亞種的一個變種，原產(chǎn)中國，是華南地區(qū)重要的特產(chǎn)蔬菜之一。利用分子標(biāo)記技術(shù)進(jìn)行菜薹雄性不育和抽薹性基因定位對菜薹品質(zhì)創(chuàng)新和選育新品種具有重要意義。目前尚未見有利用ISSR．分子標(biāo)記技術(shù)進(jìn)行菜薹雄性不育和抽薹性分析的研究報道。本研究利用正交試驗法成功設(shè)計并優(yōu)化了菜薹ISSR技術(shù)體系

2、；同時從基因組DNA入手，利用分子標(biāo)記技術(shù)尋找與菜薹雄性不育基因相關(guān)的分子標(biāo)記；克隆菜薹雄性不育基因，為利用菜薹不育性提供基礎(chǔ)；采用BSA法對菜薹的抽薹基因進(jìn)行ISSR和SRAP標(biāo)記篩選，探索利用分子標(biāo)記進(jìn)行抽薹基因選擇的可行性，獲得了四個與菜薹抽薹基因連鎖的ISSR和SRAP分子標(biāo)記。利用ISSR和SRAP技術(shù)對一份菜薹雜交組合的雙親和Fl進(jìn)行了引物篩選，初步建立了應(yīng)用于鑒定菜薹親本及其Fl的分子指紋圖譜，并轉(zhuǎn)化為數(shù)字指紋圖譜。研究的

3、主要結(jié)果如下： 1.利用正交試驗設(shè)計方法，從TaqDNA聚合酶、dNTP、引物、Mg2+4種因素3個水平對菜薹ISSR反應(yīng)體系進(jìn)行了優(yōu)化，確立了適合菜薹的ISSR反應(yīng)體系并在7個菜薹品種中進(jìn)行了驗證。在20μL反應(yīng)體系中，含TaqDNA聚合酶IU、dNTP250μmol/L、引物0.25μmol/L、1 xPCR buffer、Mg2+2.5mmol/L，、模板DNA30ng。通過梯度PCR測驗，確定了適宜的退火溫度。這一體系的

4、建立為今后利用ISSR技術(shù)進(jìn)行菜薹種質(zhì)資源分類、遺傳圖譜構(gòu)建和基因定位奠定了技術(shù)基礎(chǔ)。 2.利用ISSR技術(shù)對菜薹雄性不育系及其保持系的基因組DNA進(jìn)行比較分析；同時基于同源序列的候選基因法，通過檢索NCBI核酸數(shù)據(jù)庫，獲得細(xì)胞質(zhì)雄性不育相關(guān)的基因或開放閱讀框序列。運用生物學(xué)軟件分析方法，根據(jù)保守區(qū)設(shè)計l對CMS特異引物，對不育系和保持系的基因組DNA進(jìn)行PCR擴增。100個ISSR引物中，只有引物UBC843在兩系之間擴增出了

5、差異性條帶，找到了不育系和保持系間的特異擴增片段?；厥赵撎禺悢U增片段并進(jìn)行克隆測序，測序結(jié)果表明該片段全長為462bp，與白菜其它育性相關(guān)序列比較，同源性均低于50％。根據(jù)測序結(jié)果設(shè)計了1對特異引物，將其轉(zhuǎn)化為更穩(wěn)定的SCAR標(biāo)記。CMS特異引物標(biāo)記在不育系中擴增出675bp的特異片段。序列分析表明該片段與Pol型胞質(zhì)不育orf224基因同源性為100％。ISSR引物擴增得到的特異片段很有可能來自核DNA，CMS特異擴增結(jié)果表明實驗所用

6、的菜薹其不育類型為胞質(zhì)Pol型。 3.本研究以早抽薹品種CT07和晚抽薹品種T0601為親本構(gòu)建了F2分離群體。用45條ISSR引物和20對SRAP引物組合進(jìn)行PCR．?dāng)U增篩選，其中LJBC834、UBC876、E13M4和E5M7對親本和DNA池間的擴增圖譜表明，四個引物的差異條帶均出現(xiàn)在父本和早現(xiàn)蕾池中。經(jīng)F2代群體單株驗證，四個標(biāo)記均與早抽薹基因相連鎖，且標(biāo)記E13M4最近，距離為16.8cM，這為菜薹抽薹基因的定位和分子