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文檔簡介
1、研究背景: 急性排斥反應(yīng)是肝移植嚴重并發(fā)癥之一,也是造成移植物失功及發(fā)生慢性排斥反應(yīng)而影響移植物長期存活的重要原因。近年越來越多的研究表明趨化因子CXC亞族包括Mig、IP10、ITAC及其受體CXCR3在急性排斥反應(yīng)的發(fā)生、發(fā)展中起到關(guān)鍵作用。Fammy,N.M等通過對30例心臟移植病例316次心臟組織活檢結(jié)果與IP-10,Mig,I-TAC及其受體CXCR3表達的比較,顯示在病理報告確定為2級和3級急性排斥反應(yīng)的患者血液中,
2、IP-10,Mig,ITAC及其受體CXCR3表達明顯增加,且其增加的幅度與急性排斥反應(yīng)的嚴重程度正相關(guān)。Zhang,Z等觀察發(fā)現(xiàn),小腸移植術(shù)后3天,Th1細胞因子和趨化因子(包括IP-10,Mig,ITAC)的mRNA明顯上調(diào),表達增加。IP-10(+/+)的小腸移植后快速發(fā)生急性排斥反應(yīng),移植物內(nèi)可見大量CXCR3(+)的宿主T淋巴細胞,是對照組的7倍以上。而IP-10(-/-)的小腸移植后,CXCR3(+)宿主T淋巴細胞明顯減少,
3、排斥反應(yīng)明顯延緩。因此對其作用通道的干預(yù),可能對防止肝移植術(shù)后急性排斥反應(yīng)的發(fā)生和減輕全身或局部的炎癥反應(yīng)起較好的作用。 反義技術(shù)是應(yīng)用序列互補的反義DNA(asDNA)或反義RNA(asRNA)下調(diào)特異基因表達的應(yīng)用技術(shù)。肽核酸(PNA)是20世紀80年代有機化學(xué)家Ole Buchardt和生化學(xué)家Peter Nidscn研制合成的一種新型的序列特異性核酸制劑,是以肽鍵(NH-CO)替代核酸天然骨架3',5'-磷酸二酯鍵的核酸
4、類似物。反義肽核酸(asPNA)是核酸鏈互補的PNA,與其他PNA-樣,其化學(xué)和生物學(xué)性質(zhì)都很穩(wěn)定,而且到目前為止還未發(fā)現(xiàn)對細胞有任何毒性,不僅將成為基因治療劑,而且已經(jīng)成為分子生物學(xué)和生物技術(shù)的一個分子工具。asPNA影響基因復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和翻譯。PNA可與DNA形成穩(wěn)定的三聯(lián)體結(jié)構(gòu)或鏈侵襲或鏈置換復(fù)合體,從結(jié)構(gòu)上妨礙并阻斷RNA聚合酶的功能,從而干擾基因轉(zhuǎn)錄。asPNA抑制翻譯基于其在RNA加工、轉(zhuǎn)運或翻譯過程中的空間阻隔作用。覆蓋AU
5、G起始密碼子的PNA二聚體或三聚體可抑制翻譯,與mRNA編碼區(qū)結(jié)合的PNA三聚體也能阻止翻譯。在翻譯的延伸階段,只有兩個PNA分子與具有10~15個同型嘌呤的靶序列RNA形成三聯(lián)體才能阻止翻譯的延伸。另外PNA2/RNA形成的三聯(lián)體也能使翻譯停止。目前,在利用asPNA技術(shù)調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)方面,已開展了一些探索。Karras等根據(jù)樹突狀細胞分子CD86基因設(shè)計的asPNA成功地阻斷了第二信號的轉(zhuǎn)導(dǎo),抑制了相關(guān)T細胞的功能,從而為延長器官移植
6、患者的生存時間提供了一種可能的治療方案。Jiankuo M等在大鼠同種異體皮膚移植實驗中。運用CXCR3的反義肽核酸,當PNA-CXCR3的劑量達到10mg/kg/day時,移植皮膚存活時間明顯延長。而Yang.L等使用劑量達到2.5mg/kg/day時,即對胰島移植物產(chǎn)生了明顯的抗排斥作用??紤]機制是PNA直接阻斷了CXCR3在T細胞上的表達,導(dǎo)致T細胞介導(dǎo)的急性排斥反應(yīng)降低,在mRNA和蛋白水平的研究都證實了上述情況。肝移植作為臨床
7、廣泛開展的大器官移植手術(shù),其用于研究的動物模型也比較成熟。Lewis→BN的大鼠肝移植模型是目前確定的原位肝移植急性排斥模型,不使用免疫抑制藥物,一般受體生存期不超過7~14天,是目前在基礎(chǔ)研究中廣泛采用的動物模型。 基于以上的研究背景下,本課題立足于臨床,檢測臨床患者外周血中趨化因子CXC亞族Mig、IP-10、ITAC及其受體CXCR3在肝移植急性排斥反應(yīng)發(fā)生前后的動態(tài)變化;“二袖套”法建立BN大鼠原位肝移植模型和急性排斥模
8、型,檢測術(shù)前1天、術(shù)后1、3、5、7天的趨化因子CXC亞族Mig、IP-10、ITAC及其受體CXCR3的表達;利用as-PNA技術(shù),干預(yù)CXCR3的表達,觀察移植物存活時間和病理狀況。旨在初步探討趨化因子CXC亞族及其受體CXCR3在肝移植急性排斥反應(yīng)中的作用,尋求早期診斷急性排斥反應(yīng)的新方法,為肝移植急性排斥反應(yīng)的治療提供新的方向。 第一部分:趨化因子CXC及其受體CXCR3在肝移植后急性排斥早期診斷中的應(yīng)用 [目的
9、]: 1.探討趨化因子Mig、IP10、ITAC及其受體CXCR3的表達在肝移植術(shù)后一周內(nèi)的動態(tài)變化。 2.綜合分析趨化因子Mig、IP10、ITAC及其受體CXCR3動態(tài)檢測與臨床病理檢測結(jié)果的關(guān)系,探討這種方法在預(yù)示急性排斥反應(yīng)中的作用。 [方法]: 1.隨機抽取30例于2005年4月~2005年9月在我院因終末期肝病行原位肝移植術(shù)的住院病人,男26例,女4例,平均年齡41.7±3.62歲(30~51
10、歲)。受者原發(fā)疾?。焊窝缀蟾斡不?5例,原發(fā)性肝癌9例急性肝功能衰竭3例,酒精性肝硬化1例,原發(fā)性膽汁性肝硬化2例。供、受者血型相同24例,血型不同但符合輸血原則6例。手術(shù)采用經(jīng)典式肝移植28例,同種異體背馱式原位肝移植術(shù)2例。另選擇我院肝癌肝硬化病人15例,男性10例,女性5例,平均年齡41.56±2.63歲作為對照組,健康者志愿者16例,男性12例,女性4例,平均年齡40.8±3.61歲作為正常對照組。 2.全血CXCR3的
11、檢測,靜脈血3ml,肝素抗凝,通過流式細胞儀檢測患者全血趨化因子CXCR3的表達。 3.血清Mig、IP10、ITAC的檢測,采用雙抗體夾心ELISA方法。 4.采用SPSS 13.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)處理,結(jié)果用均數(shù)±標準差表示,各組間比較用t檢驗,排斥前后比較用配對t檢驗進行顯著性分析,P<0.05為有顯著性差異。 [結(jié)果]: 1.在術(shù)后1、3、5、7dAR組的患者趨化因子Mig、IP10、ITAC
12、的表達均明顯升高,各時間點與NAR組、肝癌肝硬化組及正常人對照組有明顯差異(P<0.01)。 2.在術(shù)后1、3、5、7dAR組的患者淋巴細胞趨化因子受體CXCR3的表達均明顯升高,各時間點與NAR組、肝癌肝硬化組及正常人對照組有明顯差異(P<0.01)。 3.AR組9例在排斥當天檢測淋巴細胞趨化因子受體CXCR3陽性率明顯升高與術(shù)前相比有顯著性差異(P<0.01),當AR組經(jīng)沖擊治療逆轉(zhuǎn)后淋巴細胞趨化因子受體CXCR3表
13、達明顯下降并維持較低水平。AR組排斥當天外周血CXCR3陽性率與RAI呈正相關(guān),相關(guān)系數(shù)(r)0.82。 [結(jié)論]: 1.外周血中淋巴細胞趨化因子受體CXCR3的表達與排斥反應(yīng)密切相關(guān),可作為診斷急性排斥反應(yīng)是否發(fā)生的輔助診斷依據(jù),以及觀察抗排異療效的指標。 2.血清中趨化因子Mig、IP10、ITAC的表達可以作為診斷急性排斥反應(yīng)較特異、敏感的依據(jù),可作為觀察抗排異治療是否有效的指標。 3.趨化因子Mi
14、g、IP10、ITAC及其受體CXCR3的表達與肝移植急性排斥反應(yīng)密切相關(guān),CXCR3途徑參與了急性排斥的發(fā)生和發(fā)展。 第二部分:趨化因子CXC亞族及其受體CXCR3在大鼠肝移植急性排斥反應(yīng)中的作用 [目的]: 1.探討趨化因子Mig、IP10、ITAC及其受體CXCR3的表達在大鼠肝移植手術(shù)前后的動態(tài)變化。 2.探討趨化因子及其受體CXCR3表達的動態(tài)變化在預(yù)示肝移植急性排斥反應(yīng)中的作用。 [方
15、法]: 1.改良“二袖套”法建立大鼠原位肝移植模型和急性排斥模型。分為4組:手術(shù)創(chuàng)傷組(第1組,6只):SD大鼠行部分肝葉切除術(shù);肝移植無排斥組(第2組,6對):SD→SD行肝移植術(shù);肝移植急性排斥組(第3組,6對):Lwis→BN行肝移植術(shù);肝移植免疫抑制劑組(第4組,10對):Lewis→BN行肝移植術(shù)+FK506飼服(1.0mg/Kg.天)。受體存活3 d以下認為有手術(shù)并發(fā)癥發(fā)生,不進入實驗觀察。每組分別于術(shù)前1天,術(shù)后1
16、、3、5、7天抽取靜脈血0.2ml。第3組分別于術(shù)后1、3、5、7天隨機取一受體用于組織病理檢查。術(shù)后7天處死大鼠,作組織病理檢查。 2.ELISA法檢測血清Mig、IP10、ITAC表達。流式細胞儀檢測外周血淋巴細胞CXCR3的表達,用Cellquest軟件分析陽性細胞百分率。半定量RT-PCR檢測各組第7天肝臟組織CXCR3-mRNA的表達。術(shù)后1、3、5、7d開腹后活檢,根據(jù)Banff97方案中的移植肝組織急性排斥反應(yīng)病理
17、學(xué)評分標準,計算AR組大鼠術(shù)后各時相的排斥活性指數(shù)(Rejiection active index,RAI)評分中位數(shù)。 3.統(tǒng)計學(xué)分析:應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析,多組均數(shù)比較采用重復(fù)測量分析。P<0.05為有顯著性差異。 [結(jié)論]: 1.血清中趨化因子Mig、IP-10、ITAC的表達可以作為診斷急性排斥反應(yīng)較特異、敏感的指標。 2.外周血中淋巴細胞趨化因子受體CXCR3的表達與排斥反
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