NK細(xì)胞分泌IL-10、TGF-β水平與HIV疾病進(jìn)展關(guān)系研究.pdf

1、目的：
　　 獲得性免疫缺陷綜合征(acquired immuno deficiency syndrome,AIDS)又稱艾滋病,是由人類免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus,HIV)感染引起的以CD4+T細(xì)胞顯著減少為主要特征,最終伴有反復(fù)機(jī)會(huì)性感染、惡性腫瘤而導(dǎo)致死亡的感染性疾病。在HIV感染過(guò)程中,天然免疫和獲得性免疫系統(tǒng)一方面受到病毒感染的損害,細(xì)胞數(shù)量和功能發(fā)生變化,另一方面依舊發(fā)揮抗

2、病毒的作用,抑制病毒復(fù)制。自然殺傷細(xì)胞(natural killercell,NK)是天然免疫系統(tǒng)中的重要效應(yīng)細(xì)胞,可直接殺傷腫瘤或病毒感染的細(xì)胞,在機(jī)體早期控制腫瘤和病毒感染中發(fā)揮重要作用。研究表明NK細(xì)胞也具有免疫調(diào)節(jié)功能,主要通過(guò)與其他免疫細(xì)胞如T、DC、巨噬和內(nèi)皮細(xì)胞等相互作用及分泌細(xì)胞因子與趨化因子兩種方式發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用。最近研究發(fā)現(xiàn)NK細(xì)胞可通過(guò)分泌免疫調(diào)節(jié)性細(xì)胞因子白細(xì)胞介素10(inter leukin-10,IL-1

3、0)、轉(zhuǎn)移生長(zhǎng)因子(transforming growth factor-β,TGF-β)調(diào)節(jié)自身及其他免疫細(xì)胞反應(yīng)。目前訂研究只發(fā)現(xiàn)正常人NK細(xì)胞在體外刺激下,可以分泌IL-10、TGF-β,但足對(duì)于HIV感染者NK細(xì)胞分泌調(diào)節(jié)性細(xì)胞因子IL-10、TGF-β情況,及其與HIV疾病進(jìn)展的關(guān)系,國(guó)內(nèi)外尚未報(bào)道。本研究以感染HIV的男男同性戀人群為研究對(duì)緣,應(yīng)用多色流式細(xì)胞分析技術(shù),探討HIV感染者NK細(xì)胞分泌IL-10和TGF-β情況以

4、及與HIV感染疾病進(jìn)展之間的關(guān)系。
　　 方法：
　　 1、研究對(duì)象
　　 29例HIV抗體陽(yáng)性感染者,未接受過(guò)抗病毒治療,且無(wú)明顯機(jī)會(huì)性感染。12例正常對(duì)照(HIV-negativenormal control,NC),HIV抗體陰性,血常規(guī)及肝腎功正常,無(wú)免疫系統(tǒng)疾病。本研究?jī)?nèi)容獲得參加者的書面知情同意。
　　 2、CD4+T細(xì)胞絕對(duì)值檢測(cè)
　　 將20μlBD公司CD4-FITC/CD8-P

5、E/CD3-PerCP試劑加入絕對(duì)計(jì)數(shù)管中,逆向加樣法加入50μl混勻的抗凝全血,室溫避光15min,加入1×免洗溶血素450μl,室溫避光15min,應(yīng)用FACSCalibur流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè),MultiSET軟件分析結(jié)果,得到CD4+T淋巴細(xì)胞的絕對(duì)值。
　　 3、NK細(xì)胞百分比及其分泌IL-10、TGF-β的檢測(cè)
　　 密度梯度離心法提取外周血單個(gè)核細(xì)胞:加或不加rIL-12(10ng/ml)與rIL-15(50

6、ng/ml)刺激PBMC,1小時(shí)后加GolgiStop,37℃,5%CO2共孵育培養(yǎng)6小時(shí);用PBS洗滌PBMC后,加抗體CD3-Percp與CD56-PE-cy7進(jìn)行表面避光染色,4℃,30分鐘;使用BDCytofix/CytopermTMFixation/PermeabilizationKit進(jìn)行破膜20分鐘,洗滌細(xì)胞后,用IL-10-APC和TGF-β-PE胞內(nèi)避光染色,4℃,30分鐘:洗滌細(xì)胞后用1%多聚甲醛固定。應(yīng)用FACSL

7、SRII流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè),BDFACSDivaTM軟件分析結(jié)果。
　　 4、IL-10、TGF-β對(duì)NK細(xì)胞功能影響的測(cè)定
　　 分別采用重組IL-10、TGF-β與PMBC共培養(yǎng)6小時(shí)、24小時(shí)、48小時(shí),直接標(biāo)記CD107a-PE,在收細(xì)胞前5小時(shí)加GolgiStop(美國(guó)BD公司),37℃,5%CO2共孵育培養(yǎng);用PBS洗滌PBMC后,加抗體CD3-Percp與CD56-Pe-cy7(美國(guó)BD公司)進(jìn)行表面避光染

8、色,4℃,30分鐘;使用BDCytofix/CytopermTMFixation/PermeabilizationKit(美國(guó)BD公司)進(jìn)行破膜20分鐘,洗滌細(xì)胞后,用IFN-γ-APC(美國(guó)BD公司)胞內(nèi)避光染色,4℃,30分鐘;洗滌細(xì)胞后用1%多聚四醛固定。應(yīng)用FACSLSRII流式細(xì)胞儀進(jìn)行槍測(cè),BDFACSDivaTM軟件分析結(jié)果。
　　 5、HIV病毒載量測(cè)定
　　 取1mlEDTA抗凝血漿,采用Roche公司

9、COBAS(R)AmpliPrep(R)/COBAS(R)TaqMan(R)System自動(dòng)載量?jī)x上以實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法測(cè)定病毒載量。全部操作按照操作說(shuō)明書進(jìn)行。
　　 6、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
　　 應(yīng)用SPSS17.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,所有數(shù)據(jù)以中位數(shù)表示,兩組間實(shí)驗(yàn)指標(biāo)的比較采用Mann-WhitneyU檢驗(yàn),相關(guān)性分析采用Spearman秩相關(guān)檢驗(yàn),P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)果：
　　 一

10、、HIV感染者NK細(xì)胞及各亞群分泌IL-10、TGF-β的特點(diǎn)
　　 1、HIV感染者NK細(xì)胞及各亞群構(gòu)成情況
　　 本研究對(duì)HIV感染者及正常對(duì)照組(NC組),檢測(cè)NK細(xì)胞及各亞群占淋巴細(xì)胞百分比。結(jié)果顯示:與NC組相比較,HIV感染者NK細(xì)胞、CD56dimNK細(xì)胞百分比均降低(P=0.014,P=0.015),CD56brightNK細(xì)胞百分比有降低趨勢(shì),但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　 根據(jù)CD4高低分組:HIV感

11、染者NK細(xì)胞、CD56dimNK細(xì)胞百分比在CD4＜350個(gè)/ul組均低于NC組(P=0.012,P=0.014),CD56brightNK細(xì)胞百分比在CD4≥350個(gè)/ul組低于NC組(P=0.041)。
　　 根據(jù)病毒載量高低分組:病毒載量≥104拷貝/ml組HIV感染者NK細(xì)胞、CD56dimNK細(xì)胞百分比亦低于NC組(P=0.020,P=0.022),CD56brightNK細(xì)胞百分比有降低趨勢(shì),但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。病毒載量

12、＜104拷貝/ml組NK細(xì)胞及各亞群百分比均有有降低趨勢(shì),但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　 2、HIV感染者NK細(xì)胞分泌IL-10、TGF-β情況
　　 應(yīng)用多色流式細(xì)胞儀胞內(nèi)細(xì)胞因子染色(ICS)方法檢測(cè)NK細(xì)胞分泌IL-10和TGF-β水平。結(jié)果顯示:HIV感染者NK細(xì)胞分泌IL-10、TGF-β水平有高于健康對(duì)照組(NC組)趨辨,但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　 根據(jù)CD4高低分組:HIV感染者NK細(xì)胞分泌IL-10、TGF-

13、β水平有高于健康對(duì)照組趨勢(shì),但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　 根據(jù)病毒載量高低分組:病毒載量＜104拷貝/ml組HIV感染者NK細(xì)胞分泌TGF-β水平高于NC組(P=0.049)。
　　 CD4＜350個(gè)/ul且病毒載量≥104拷貝/mlHIV感染者NK細(xì)胞分泌IL-10、TGF-β水平亦有高于NC組趨勢(shì),但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　 3、HIV感染者NK細(xì)胞各及亞群分泌IL-10、TGF-β水平與CD4+T細(xì)胞數(shù)量及HIV病毒

14、載量的相關(guān)性
　　 HW感染者NK細(xì)胞分泌IL-10、TGF-β水平與CD4+T細(xì)胞數(shù)量、HIV病毒載量無(wú)顯著相關(guān)性,無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。CD56brightNK細(xì)胞分泌IL-10水平與HIV病毒載量顯著正相關(guān)(r=0.525,P=0.003),而CD56dimNK細(xì)胞分泌IL-10水平與HIV病毒載量無(wú)顯著相關(guān)性。
　　 根據(jù)CD4高低分組:CD4＜350個(gè)/ul組HIV感染者NK細(xì)胞分泌IL-10水平與CD4+T細(xì)胞數(shù)量呈

15、負(fù)相關(guān)(r=-0.582,P=0.037),而CD4≥350個(gè)/ul組HIV感染者NK細(xì)胞分泌IL-10水平與CD4+T細(xì)胞數(shù)量無(wú)相關(guān)性(r=0.221,P=0.412)。
　　 根據(jù)病毒載量高低分組:病毒載量≥104拷貝/ml組HIV感染者NK細(xì)胞分泌IL-10水平與HIV病毒載量正相關(guān)(r=0.542,P=0.020)。在CD56dimNK細(xì)胞和CD56brightNK細(xì)胞亞群中發(fā)現(xiàn)相似結(jié)果:分泌IL-10水平與HIV病毒載

16、量正相關(guān)(r=0.579,P=0.012:r=0.496,P=0.036)。病毒載量＜104拷貝/ml組HIV感染者NK細(xì)胞分泌IL-10水平與HIV病毒載量無(wú)相關(guān)性。
　　 CD4＜350個(gè)/ul且病毒載量≥104拷貝/mlHIV感染者:NK細(xì)胞分泌IL-10水平與CD4+T細(xì)胞數(shù)最顯著負(fù)相關(guān)(r=-0.867,P=0.001),與HIV病毒載量呈正相關(guān)趨勢(shì)(r=0.588,P=0.074):在CD56dimNK細(xì)胞發(fā)現(xiàn)相似結(jié)

17、果:分泌IL-10水平與CD4+T細(xì)胞數(shù)最負(fù)相關(guān)(r=-0.661,P=0.038),與HIV病毒載量正相關(guān)(r=0.697,P=0.025);CD56brightNK細(xì)胞分泌IL-10水平與CD4+T細(xì)胞數(shù)量呈負(fù)相關(guān)趨勢(shì)(r=-0.491,P=0.150),與HIV病毒載量呈正相關(guān)趨勢(shì)(r=0.552,P=0.098),但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 二、IL-12與IL-15體外刺激HIV感染者NK細(xì)胞及各亞群分泌IL-10、TGF

18、-β特點(diǎn)
　　 1、IL-12與IL-15體外刺激HIV感染者NK細(xì)胞分泌IL-10、TGF-β情況
　　 采用10ng/ml重組IL-12與50ng/ml重組IL-15體外刺激,應(yīng)用多色流式細(xì)胞儀胞內(nèi)細(xì)胞因子染色(ICS)方法檢測(cè)NK細(xì)胞分泌IL-10和TGF-β水平。結(jié)果顯示:結(jié)果顯示:重組IL-12與IL-15體外刺激后,HIV感染者NK細(xì)胞分泌IL-10水平高于NC組(P=0.014),分泌TGF-β水平有高于N

19、C組趨勢(shì)(P=0.059),但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　 根據(jù)CD4高低分組,CD4＜350個(gè)/ul組HIV感染者NK細(xì)胞分泌IL-10水平高于NC組(P=0.017),分泌TGF-β水平有高于NC組趨勢(shì),但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。CD4≥350個(gè)/ul組NK細(xì)胞分泌IL-10水平有高于NC組趨勢(shì),但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,分泌TGF-β水平高于NC組(P=0.029)。
　　 根據(jù)病毒載量高低分組,病毒載量≥104拷貝/ml組NK細(xì)胞分泌IL-

20、10水平高于NC組(P=0.014),分泌TGF-β水平有高于NC組趨勢(shì),但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。病毒載量＜104拷貝/ml組NK細(xì)胞分泌IL-10水平有高于NC組趨勢(shì),但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,分泌TGF-β水平高于NC組(P=0.016)。
　　 CD4＜350個(gè)/ul且病毒載量≥104拷貝/mlHIV感染者NK細(xì)胞分泌IL-10水平高于NC組(P=0.018),分泌TGF-β水平有高于NC組趨勢(shì),但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　 2、IL-1

21、2與IL-15體外刺激HIV感染者NK細(xì)胞及各亞群分泌IL-10、TGF-β水平與CD4+T細(xì)胞計(jì)數(shù)及HIV病毒載量的相關(guān)性
　　 rIL-12/rIL-15體外刺激后,HIV感染者NK細(xì)胞分泌IL-10、TGF-β水平與CD4+T細(xì)胞數(shù)量、HIV病毒載量無(wú)顯著相關(guān)性,無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。但CD56brightNK細(xì)胞分泌IL-10水平與HIV病毒載量正相關(guān)(r=0.449,P=0.014),CD56dimNK細(xì)胞分泌IL-10水平與

22、HIV病毒載量無(wú)相關(guān)性(r=0.221,P=0.412)。
　　 CD4＜350個(gè)/ul且病毒載量≥104拷貝/mlHIV感染者:NK細(xì)胞分泌IL-10水平與CD4+T細(xì)胞數(shù)量負(fù)相關(guān)(r=-0.673,P=0.033),與HIV病毒載量呈正相關(guān)相關(guān)趨勢(shì)(r=0.552,P=0.098);在CD56dimNK細(xì)胞、CD56brightNK細(xì)胞發(fā)現(xiàn)相似結(jié)果:分泌IL-10水平與HIV病毒載量呈正相關(guān)趨勢(shì),但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(r=0.58

23、8,P=0.074;r=0.564,P=0.090)。
　　 三、IL-10、TGF-β對(duì)NK細(xì)胞分泌IFN-γ、CD107a功能影響
　　 采用重組IL-10與TGF-β體外與NK細(xì)胞共培養(yǎng),觀察其對(duì)NK細(xì)胞分泌IFN-γ、CD107a水平的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn):rIL-10在24h時(shí)明顯抑制NK細(xì)胞分泌IFN-γ,抑制率達(dá)82%;NK細(xì)胞分泌CD107a水平在48h時(shí)明顯被rIL-10抑制,抑制率達(dá)34%。rTGF-β在2

24、4h時(shí)明顯抑制NK細(xì)胞分泌IFN-γ,抑制率達(dá)100%NK細(xì)胞分泌CD107a水平在24h時(shí)亦明顯被rTGF-β抑制,抑制率達(dá)57%。
　　 結(jié)論：
　　 1、HIV感染者NK細(xì)胞分泌IL-10水平較正常對(duì)照增高,分泌TGF-β水平有增高趨勢(shì)。提示HIV感染導(dǎo)致NK細(xì)胞分泌抑制性細(xì)胞因子IL-10、TGF-β水平增多。
　　 2、CD4＜350個(gè)/ul且病毒載量≥104拷貝/mlHIV感染者CD56dimNK細(xì)胞