髓系抑制性細胞負性因子配體與HIV疾病進展關(guān)系研究.pdf

1、目的:
　　HIV感染人體后，免疫系統(tǒng)針對病毒產(chǎn)生細胞毒等多種抗病毒免疫應(yīng)答，感染者可以短暫的控制病毒血癥，但是病毒仍然在復(fù)制，病毒血癥難以被完全控制。T細胞是適應(yīng)性免疫應(yīng)答的組成部分，在對抗HIV中具有重要作用，但是大多數(shù)HIV慢性感染者T細胞出現(xiàn)功能耗竭和無能，而導(dǎo)致T細胞功能損傷的原因尚未完全闡明。
　　髓系抑制性細胞(Myeloid-derived suppressor cell，MDSC)，是一群異源群體細胞，由骨

2、髓祖細胞和未成熟的骨髓細胞(IMCs)組成。大量研究顯示MDSC具有免疫抑制作用，這種抑制性作用與精氨酸酶（Arg-1）、一氧化氮合酶(iNOS)、活性氧(ROS)、過氧硝酸鹽有關(guān)。負性因子是免疫耗竭的標志，在高度活化和功能耗竭的T淋巴細胞上大量表達，對免疫活化有抑制作用。PD-1、Tim-3是兩種比較重要的負性因子，PD-1與其配體PD-L1結(jié)合后能夠負性調(diào)節(jié)T細胞的功能，抑制T細胞增殖，下調(diào)效應(yīng)因子IL-2、IFN-γ的產(chǎn)生;Tim

3、-3與配體Gal-9的結(jié)合可以抑制CD4+T細胞分泌細胞因子，如IFN-γ、IL-2、IL-6、IL-17等。在小鼠卵巢癌模型的研究顯示，MDSC高表達PD-L1和CD80，阻斷PD-L1和CD80后能夠抑制MDSC的功能，而PD-L1和CD80的這種抑制性作用是通過與Treg表面的PD-1和CTLA-4相互作用實現(xiàn)的。以往研究證實Tim-3通過直接誘導(dǎo)細胞凋亡和耗竭來抑制免疫應(yīng)答，但是近期的一些研究中發(fā)現(xiàn)T細胞上Tim-3的表達還能夠

4、通過擴增MDSC間接性的抑制免疫應(yīng)答，而Tim-3的這種作用與MDSC表面Tim-3的配體Gal-9有關(guān)。
　　在HIV感染中關(guān)于MDSC的研究僅限兩篇，關(guān)于MDSC的研究表型不一致，研究的人群也局限于慢性感染者，在HIV感染早期，MDSC的數(shù)量可能會決定疾病預(yù)后，對于HIV感染早期MDSC表達情況以及與疾病進展的關(guān)系還未見報道，這群MDSC表面負性因子配體PD-L1和Gal-9的表達情況如何尚無報道。
　　本研究擬對不同感

5、染階段HIV感染者MDSC進行研究，明確急性期HIV感染者MDSC的表達變化以及與疾病進展的關(guān)系，并研究HIV感染者MDSC表面PD-L1和Gal-9表達情況，探索MDSC抑制作用與PD-L1和Gal-9的關(guān)系。
　　方法:
　　1、研究對象
　　32例無癥狀HIV慢性感染者(CHI)、15例無癥狀HIV急性期感染者(PHI)均來自中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院紅絲帶門診，感染途徑多為男男性接觸，CHI患者感染時間一年以上，

6、PHI患者感染時間180天以內(nèi)，在檢測時間點均未接受HAART治療;10例健康對照為隨機抽取的HIV抗體陰性、未暴露于HIV的健康人(NC);8例腫瘤未治療患者。HIV及NC組年齡、性別經(jīng)檢驗均無顯著性差異。
　　2、MDSC表型檢測
　　實驗對象每人抽取1.5ml全血，提取PBMC。提取的PBMC用PBS洗一遍后進行表面染色。MDSC:CD14PE-Cy-7、CD11bAPC、HLA-DRAPC-Cy-7、CD33FITC

7、;活化:CD3PE-Cy-7、CD4APC-Cy-7、CD8Percp、CD38FITC、HLA-DRAPC;負性因子:CD3PE-Cy-7、CD4APC-Cy-7、CD8Percp、PD-1FITC、Tim-3PE。室溫避光染色20min。染色后用PBS洗一遍，上樣前每管補多聚甲醛150ul。流式檢測CD14-/+HLA-DR-/lowCD33+CD11b+細胞。
　　3、MDSC抑制功能檢測
　　30ml全血提取急性期H

8、IV感染者PBMC，20ml全血提取健康人PBMC，活細胞計數(shù)。磁珠負選健康人CD8+T細胞，染CFSE，流式分選HIV感染者MDSC（表面染色CD14、CD11b、CD33、HLA-DR），分選后的MDSC與健康人CD8+T細胞以2:1比例孵育3天，進行CD8+T細胞增殖檢測。孵育后的細胞取出后用PBS洗一遍，進行表面染色(CD8)，4度避光染色30min。染色后用PBS洗一遍，上樣前每管補多聚甲醛150ul。流式檢測CD8+T細胞的

9、增殖情況。
　　4、MDSC表面PD-L1、Gal-9檢測
　　實驗對象每人抽取1.5ml全血，提取PBMC。提取的PBMC用PBS洗一遍，按流式管數(shù)目補PBS，然后每管加入100ul細胞懸液進行表面染色，CD14PE-Cy-7、CD11bAPC、HLA-DRAPC-Cy-7、CD33FITC，PD-L1PE、Gal-9PE，室溫避光染色20min。染色后用PBS洗一遍，上樣前每管補多聚甲醛150ul。流式檢測HLA-DR-

10、/lowCD14-CD33+CD11bhigh上PD-L1和Gal-9的表達量。
　　5、CD4+T細胞絕對值及病毒載量檢測
　　CD4+T細胞絕對值依據(jù)1997年美國CDC關(guān)于HIV感染者CD4+T細胞檢測指導(dǎo)方法，應(yīng)用BD公司TruCOUNT管、FACSCalibur流式細胞儀MULTISET軟件檢測。病毒載量采用Roche公司COBAS(@)AmpliPrep(@)/COBAS(@)TaqMan(@)System自動載

11、量儀上以實時熒光定量PCR方法測定病毒載量。
　　6、統(tǒng)計學(xué)分析
　　應(yīng)用SPSS17.0軟件包進行統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)以MeanwithSEM表示，兩組間實驗指標的比較采用Mann-WhitneyU檢驗兩組間的差異性，相關(guān)性分析采用Spearman秩相關(guān)檢驗，相關(guān)的兩組之間的比較用兩配對樣本檢驗(Wilcoxon)，P＜0.05為有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　實驗結(jié)果:
　　一、HIV急性期感染者HLA-DR-/lowCD14

12、-CD33+CD11bhigh細胞表達增加
　　我們首先對髓系抑制性細胞的表型進行研究，以CD14-和CD14+來區(qū)分單核細胞MDSC和粒細胞MDSC，結(jié)果發(fā)現(xiàn)HLA-DR-/lowCD14-CD33+CD11b+有兩群細胞:HLA-DR-/lowCD14-CD33+CD11blow和HLA-DR-/lowCD14-CD33+CD11bhigh。HIV急性期感染者(p=0.03)、慢性感染者(p=0.02)和腫瘤患者(p=0.00

13、08)的HLA-DR-/lowCD14-CD33+CD11bhigh細胞百分數(shù)均高于健康人(NC)，腫瘤患者高于急性期(p=0.003)和慢性期HIV感染者(p=0.01)，而HLA-DR-/lowCD14-CD33+CD11blow和HLA-DR-/lowCD14+CD33+CD11b在四組中無顯著性差異。
　　二、HLA-DR-/lowCD14-CD33+CD11bhigh細胞能抑制CD8+T細胞增殖并且與疾病進展有關(guān)

14、　　為了驗證HLA-DR-/lowCD14-CD33+CD11bhigh細胞是否是具有抑制功能，我們進行了體外實驗，發(fā)現(xiàn)這群細胞能夠抑制CD8+T細胞增殖。我們進一步分析髓系抑制性細胞與疾病進展的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)總的HIV感染者（急性期和慢性期）HLA-DR-/lowCD14-CD33+CD11bhigh細胞百分數(shù)與CD4+T細胞的數(shù)量呈負相關(guān)(r=-0.4，p=0.005)，與載量呈正相關(guān)(r=-0.67，p＜0.0001)，與CD4+T細

15、胞的活化水平（％CD4+CD38+HLA-DR+）呈正相關(guān)(r=0.48，p=0.01)，與CD8+T細胞的活化水平無相關(guān)性;慢性期感染者HLA-DR-/lowCD14-CD33+CD11bhigh細胞百分數(shù)與CD4+T細胞的數(shù)量呈負相關(guān)(r=-0.41，p=0.02)，按CD4+T細胞大于和小于350cells/ul進行分組，發(fā)現(xiàn)CD4+T細胞大于350細胞/微升組HLA-DR-/lowCD14-CD33+CD11bhigh細胞百分數(shù)

16、有低于CD4+T細胞小于350細胞/微升組的趨勢(p=0.18)，而HLA-DR-/lowCD14-CD33+CD11bhigh細胞百分數(shù)與載量呈正相關(guān)(r=0.7，p＜0.0001)，與CD4+T細胞的活化水平(％CD4+CD38+HLA-DR+)呈正相關(guān)(r=0.65，p=0.002)，與CD8+T細胞的活化水平無相關(guān)性;急性期HIV感染者HLA-DR-/lowCD14-CD33+CD11bhigh細胞百分數(shù)與CD4+T細胞的數(shù)量呈

17、負相關(guān)(r=-0.72，p=0.0026)，按CD4+T細胞大于和小于500細胞/微升進行分組，發(fā)現(xiàn)CD4+T細胞大于細胞/微升組HLA-DR-/lowCD14-CD33+CD11bhigh細胞百分數(shù)低于CD4+T細胞小于500細胞/微升組(p=0.0054)，并且HLA-DR-/lowCD14-CD33+CD11bhigh細胞百分數(shù)與載量呈正相關(guān)(r=0.62，p=0.01)，與CD4+T細胞的活化水平(％CD4+CD38+HLA-D

18、R+)呈正相關(guān)(r=0.64，p=0.034)，與CD8+T細胞的活化水平(％CD8+CD38+HLA-DR+)有正相關(guān)的趨勢，但無統(tǒng)計學(xué)意義。
　　三、HIV感染者HLA-DR-/lowCD14-CD33+CD11bhigh細胞表面PD-L1和Gal-9表達增加
　　急性期HIV感染者(p=0.02)、慢性期HIV感染者(p＜0.0001)和腫瘤患者(p=0.0016)HLA-DR-/lowCD14-CD33+CD11bh

19、igh細胞表面PD-L1百分數(shù)高于健康人;慢性期HIV感染者(p=0.03)、腫瘤患者(p=0.026)HLA-DR-/lowCD14-CD33+CD11bhigh細胞表面Gal-9百分數(shù)高于健康人;總的HIV感染者HLA-DR-/lowCD14-CD33+CD11bhigh細胞表面PD-L1百分數(shù)(r=-0.42，p=0.01)和Gal-9百分數(shù)(r=-0.4，p=0.007)與CD4數(shù)量呈負相關(guān)，與病毒載量有正相關(guān)的趨勢。慢性期HI

20、V感染者HLA-DR-/lowCD14-CD33+CD11bhigh細胞表面PD-L1百分數(shù)(r=-0.44，p=0.037)和Gal-9百分數(shù)(r=-0.38，p=0.03)與CD4+T細胞數(shù)量呈負相關(guān)，與病毒載量有正相關(guān)的趨勢。急性期HIV感染者HLA-DR-/lowCD14-CD33+CD11bhigh細胞表面PD-L1和Gal-9百分數(shù)與CD4數(shù)量和病毒載量均無相關(guān)性。
　　四、慢性期HIV感染者HLA-DR-/lowCD

21、14-CD33+CD11bhigh細胞表達量與CD4+T細胞表面TIM-3、PD-1表達有關(guān)
　　慢性期HIV感染者HLA-DR-/lowCD14-CD33+CD11bhigh細胞百分數(shù)與CD4+T細胞表面PD-1(r=0.52，p=0.02)和TIM-3(r=0.54，p=0.014)百分數(shù)呈正相關(guān)，與CD8+T細胞表面TIM-3和PD-1的百分數(shù)無關(guān)。
　　結(jié)論:
　　HIV急性期患者HLA-DR-/lowCD14