骨髓單核系、粒系來源的髓系抑制細(xì)胞的分離及鑒定.pdf

1、目的：由于缺乏有效的分離方法，目前對于髓系來源的免疫抑制細(xì)胞（Myeloid derived suppressor cells, MDSCs）的研究均停留在混合細(xì)胞水平。本實(shí)驗(yàn)旨在利用Gfi1:GFP基因敲入小鼠感染性休克模型，采用流式細(xì)胞分選技術(shù)分離骨髓單核系和粒系來源的MDSCs，并對其表型和體外免疫抑制功能加以鑒定。
　　方法：1）感染性休克小鼠模型的構(gòu)建：利用LPS連續(xù)腹腔注射方法構(gòu)建Gfi1:GFP基因敲入小鼠感染性休克

2、模型，分別于注射后第4天、第7天檢測模型小鼠血漿細(xì)胞因子分泌情況，以鑒定造模是否成功；2）骨髓單核系、粒系來源的MDSCs的分離：采用流式細(xì)胞分選技術(shù)，分離感染性休克小鼠模型骨髓中單核來源的MDSCs（CD11b+Gr1med GFP-）和粒系來源的MDSCs（CD11b+Gr1med GFP+）兩群細(xì)胞，并進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定；3）表型和功能鑒定：動(dòng)態(tài)觀察單核來源的MDSCs（CD11b+Gr1med GFP-）和粒系來源的MDSCs（CD

3、11b+Gr1med GFP+）兩群細(xì)胞在模型小鼠骨髓細(xì)胞中的比例變化和表型差異，并利用體外共培養(yǎng)技術(shù)，將分離純化的單核系和粒系來源的MDSCs亞群分別與CFSE標(biāo)記的活化CD4+T細(xì)胞共培養(yǎng)，體外檢測二者對CD4+T細(xì)胞增殖的抑制功能，同時(shí)采用real-time PCR方法檢測二者促炎因子IFN-γ和抑炎因子IL-4、IL-10、IL-13、TGF-β等細(xì)胞因子的表達(dá)情況，以及發(fā)揮免疫抑制作用所需的精氨酸酶（ArginaseⅠ,Arg

4、Ⅰ）和一氧化氮合酶2（nitric oxide synthetase2, NOS2）的表達(dá)水平。
　　結(jié)果：1)與正常對照小鼠相比，感染急性期(LPS腹腔注射24小時(shí))模型小鼠外周血各種促炎、抑炎以及趨化因子均明顯增高；與急性感染模型小鼠相比，感染性休克小鼠模型(LPS連續(xù)腹腔注射7天)外周血血漿中各種促炎因子 TNF-α、IL-6、IFN-γ、趨化因子MCP-1水平明顯降低，而抑炎因子IL-10的水平略有下降，但仍明顯高于正常對

5、照小鼠；2）利用Gfi1：GFP轉(zhuǎn)基因小鼠，根據(jù)Gfi1基因在單核系、粒系來源的MDSCs中的差異表達(dá)，可分選出純度大于99％的骨髓單核系來源的MDSCs（其表型為CD11b+Gr1med GFP-）和粒系來源的MDSCs（其表型為CD11b+Gr1med GFP+），經(jīng)Wright-Giemsa染色形態(tài)學(xué)鑒定， CD11b+Gr1med GFP+細(xì)胞主要為以中晚幼粒細(xì)胞為主的幼稚粒細(xì)胞；而CD11b+Gr1med GFP-細(xì)胞主要是幼

6、稚單核細(xì)胞；3）感染性休克模型小鼠骨髓中CD11b+的髓系細(xì)胞較正常小鼠明顯增多，在這些增多的髓系細(xì)胞中，尤以粒系來源的MDSCs為主。與正常小鼠相比， LPS連續(xù)腹腔注射4天模型小鼠骨髓粒系來源的MDSCs細(xì)胞膜表面CD124（IL-4受體）、CD210（IL-10受體）、以及Toll樣受體TLR-2和TLR-4的表達(dá)有所增加，CD62L表達(dá)有所下降，而CD80和CD86的表達(dá)則無明顯差別；單核系來源的MDSCs細(xì)胞表面TLR-2表達(dá)

7、減弱， CD124、CD210以及TLR-4表達(dá)增強(qiáng)，其他分子表達(dá)無顯著差異； LPS連續(xù)腹腔注射7天模型小鼠骨髓粒系來源的MDSCs細(xì)胞膜表面CD124、CD210和TLR-2的表達(dá)有所增加，而CD80和CD86的表達(dá)無顯著差異；單核系來源的MDSCs細(xì)胞表面TLR-2表達(dá)減弱，其他表型無明顯差別；CD11b+Gr1med GFP+與CD11b+Gr1med GFPˉ細(xì)胞均能不同程度地影響經(jīng)CD3/28刺激活化的CD4+T淋巴細(xì)胞增殖

8、，且該抑制作用隨共培養(yǎng)體系中MDSCs比例的增加而呈現(xiàn)遞增現(xiàn)象。粒系和單核系來源的骨髓MDSCs細(xì)胞均能降低CD4+T細(xì)胞的增殖活性，且尤以粒系來源的MDSCs的增殖抑制作用顯著；粒系來源的MDSCs(CD11b+Gr1med GFP+)和單核系來源的MDSCs（CD11b+Gr1med GFP-）細(xì)胞亞群的IL-4、IL-10、IL-13、IFN-γ等細(xì)胞因子以及ArgⅠ、NOS2等酶的RNA水平表達(dá)均增強(qiáng)，說明兩個(gè)細(xì)胞亞群均可通過分

9、泌各種抑制性細(xì)胞因子以及這兩種酶參與感染性休克免疫抑制。
　　結(jié)論：
　　1.利用LPS腹腔連續(xù)給藥的方法，成功建立了感染性休克小鼠模型；
　　2.利用Gfi1:GFP基因敲入小鼠，采用流式細(xì)胞分選技術(shù)，可以獲得高純度單核系和粒系來源的骨髓MDSCs；
　　3.感染性休克小鼠模型中，骨髓 MDSCs顯著增高，且以粒系來源的MDSCs為主；
　　4.感染性休克模型小鼠骨髓粒系來源的MDSCs(CD11b+Gr