TGF-β誘導(dǎo)免疫細(xì)胞耐受參與肝癌的發(fā)生發(fā)展.pdf

1、肝細(xì)胞癌(HCC)是最常見(jiàn)的、危害最大的惡性腫瘤之一,死亡率居全球惡性腫瘤的第三位。其治愈率低,預(yù)后差,容易復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移。據(jù)報(bào)道,腫瘤的發(fā)生發(fā)展與其所處的微環(huán)境密切相關(guān)。肝癌微環(huán)境主要由肝癌細(xì)胞和其周圍肝星狀細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、纖維母細(xì)胞、kupffer細(xì)胞、上皮細(xì)胞、腫瘤血管和淋巴管組成細(xì)胞、免疫細(xì)胞以及它們的分泌物質(zhì)和代謝產(chǎn)物等成分構(gòu)成。其中,樹(shù)突狀細(xì)胞(DC)作為體內(nèi)功能最強(qiáng)大的抗原提呈細(xì)胞(APC),在調(diào)節(jié) T細(xì)胞介導(dǎo)的抗腫瘤免疫應(yīng)答中

2、發(fā)揮著非常重要的作用。成熟DC(mDC)高表達(dá)MHCⅡ,與腫瘤抗原結(jié)合后形成抗原肽-MHCⅡ復(fù)合體,將腫瘤抗原呈遞給T細(xì)胞,使T細(xì)胞分化成具有殺傷能力的細(xì)胞毒性T細(xì)胞,從而有效抑制腫瘤細(xì)胞免疫逃逸。然而,腫瘤微環(huán)境中存在著多種導(dǎo)致免疫低下甚至免疫不應(yīng)答的因素。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(TGF-β)是一種廣泛存在于腫瘤微環(huán)境中的多功能細(xì)胞因子,能夠抑制免疫功能、調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長(zhǎng)和分化,且對(duì)多種腫瘤細(xì)胞具有抑制增殖或促進(jìn)凋亡作用。大量研究表明,TGF-

3、β對(duì)免疫細(xì)胞的調(diào)節(jié)作用十分復(fù)雜。調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)是一種表達(dá)CD4、CD25和轉(zhuǎn)錄因子Foxp3的T細(xì)胞亞群,在腫瘤免疫中起負(fù)向調(diào)控作用。
　　本研究旨在觀察在HCC發(fā)生發(fā)展過(guò)程中,TGF-β水平、DC表型及CD4+CD25+Foxp3+Treg比例的動(dòng)態(tài)變化,分析三者之間是否存在一定聯(lián)系,在此基礎(chǔ)上進(jìn)行一系列體外試驗(yàn)以進(jìn)一步探討TGF-β對(duì)腫瘤相關(guān)免疫細(xì)胞的調(diào)節(jié)作用以及可能的分子機(jī)制。
　　目的:觀察二乙基亞硝胺(D

4、EN)誘導(dǎo)大鼠HCC過(guò)程中,TGF-β水平、DC表型及CD4+CD25+Foxp3+Treg比例的動(dòng)態(tài)變化,揭示TGF-β誘導(dǎo)腫瘤相關(guān)免疫細(xì)胞耐受在HCC進(jìn)程中的作用,以及深入闡明TGF-β誘導(dǎo)免疫細(xì)胞耐受的分子病理機(jī)制。
　　方法:采用 DEN灌胃的方法誘導(dǎo)大鼠肝癌模型。SD大鼠隨機(jī)分為正常組和模型組。模型組大鼠灌胃給予DEN(0.1％DEN8 mg/kg/次,每天1次,每周6天),正常組給予等量的生理鹽水,共16周。分別于造模

5、的第4周,第12周和第16周處死大鼠。HE染色觀察肝組織病理學(xué)變化;流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)大鼠外周血中DC表面CD80、CD86和MHCⅡ表達(dá)及CD4+CD25+Foxp3+Treg比例;ELISA法檢測(cè)大鼠肝組織中TGF-β水平。
　　體外誘導(dǎo)培養(yǎng)小鼠骨髓來(lái)源DC,在DC培養(yǎng)d4,加入10 ng/ml TGF-β刺激DC(TGF-β-DC)。采用流式細(xì)胞術(shù)及Western blot法分析DC表型及抗原攝取能力;以小鼠脾臟來(lái)源的T淋巴細(xì)胞

6、作為反應(yīng)細(xì)胞與 DC進(jìn)行混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)(MLR),MTT法檢測(cè)DC刺激T細(xì)胞增殖的能力;ELISA法測(cè)定DC培養(yǎng)上清液中IL-10和IL-12水平。
　　體外誘導(dǎo)培養(yǎng)小鼠骨髓來(lái)源 DC,分別于培養(yǎng)的不同時(shí)間點(diǎn)、加入不同濃度的TGF-β刺激DC(TGF-β-DC)。采用流式細(xì)胞術(shù)及Western blot法檢測(cè)DC中PD-L1、STAT3和p-STAT3表達(dá);收集培養(yǎng)至6 d的DC與小鼠脾臟來(lái)源的T淋巴細(xì)胞共培養(yǎng)48 h,流式細(xì)胞

7、術(shù)檢測(cè)T細(xì)胞凋亡及CD4+CD25+Foxp3+Treg的生成情況;收集共培養(yǎng)后的T細(xì)胞與小鼠肝癌細(xì)胞(Hepa)共培養(yǎng)24 h,MTT法檢測(cè)T細(xì)胞對(duì)Hepa的殺傷率。
　　結(jié)果:
　　1 DEN誘導(dǎo)大鼠HCC病程中,TGF-β水平、DC表型及CD4+CD25+Foxp3+Treg比例的動(dòng)態(tài)變化
　　1.1 DEN誘導(dǎo)大鼠肝臟病變
　　正常大鼠肝臟紅潤(rùn),表面光滑有光澤;肝小葉結(jié)構(gòu)清晰,肝索排列整齊。DEN誘導(dǎo)后,

8、大鼠肝臟病變大致可分為3個(gè)時(shí)期:(1)炎癥損傷期:在造模第4周,肝臟表面略失去光澤;肝細(xì)胞變性、腫脹,伴有不同程度的脂肪變及炎細(xì)胞浸潤(rùn)。(2)纖維化-硬化期:在造模第12周,肝臟顏色變淺,表面粗糙;肝小葉結(jié)構(gòu)異常,被較粗大的纖維分割包繞,假小葉形成,逐漸呈肝硬化表現(xiàn)。(3)癌變期:在造模第16周,肝臟表面粗糙不平,出現(xiàn)大小不等的結(jié)節(jié),癌腫形成;癌細(xì)胞浸潤(rùn),細(xì)胞排列紊亂,異型性明顯,細(xì)胞核增大,胞質(zhì)減少。
　　1.2大鼠肝臟癌變過(guò)程

9、中TGF-β水平的變化
　　在造模第4、12和16周,與正常組比較,模型組大鼠肝組織中TGF-β水平均升高,且隨著病程進(jìn)展,TGF-β水平逐漸升高。
　　1.3大鼠肝臟癌變過(guò)程中DC表型的變化
　　1.3.1大鼠肝臟癌變過(guò)程中DC表面CD80的表達(dá)
　　在造模第4周,與正常組相比,模型組大鼠DC表面CD80表達(dá)增加,但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;在造模第12、16周,與正常組相比,模型組大鼠DC表面CD80表達(dá)顯著下降。

10、>　　1.3.2大鼠肝臟癌變過(guò)程中DC表面CD86的表達(dá)
　　在造模第4周和12周,與正常組相比,模型組大鼠DC表面CD86的表達(dá)無(wú)明顯變化。在造模第16周,與正常組相比,模型組大鼠DC表面CD86表達(dá)減少。1.3.3大鼠肝臟癌變過(guò)程中DC表面MHCⅡ的表達(dá)
　　在造模第4周,與正常組比較,模型組大鼠DC表面MHCⅡ表達(dá)明顯增加;在造模第12周,MHCⅡ表達(dá)無(wú)明顯變化;在造模第16周,與正常組比較,模型組大鼠DC表面MHCⅡ

11、表達(dá)顯著減少。
　　1.4大鼠肝臟癌變過(guò)程中CD4+CD25+Foxp3+Treg比例的變化
　　在造模第4、12和16周,與正常組比較,模型組大鼠外周血中CD4+CD25+Foxp3+Treg比例顯著增加,且隨著病程進(jìn)展,Treg比例逐漸增加。
　　2 TGF-β對(duì)DC表型和功能的影響
　　2.1小鼠骨髓來(lái)源DC的鑒定
　　1)形態(tài)學(xué)觀察
　　小鼠骨髓來(lái)源的單核細(xì)胞培養(yǎng)3-4 h貼壁,經(jīng)rmIL-4

12、(10ng/ml)、rmGM-CSF(20 ng/ml)誘導(dǎo)培養(yǎng)24 h后,倒置相差顯微鏡下觀察可見(jiàn)細(xì)胞貼壁生長(zhǎng),部分懸浮生長(zhǎng);培養(yǎng)2-3d后出現(xiàn)細(xì)胞集落,細(xì)胞體積明顯增大,貼壁細(xì)胞逐漸減少,可見(jiàn)少量具有樹(shù)突樣突起的懸浮細(xì)胞。培養(yǎng)至5d時(shí)可見(jiàn)樹(shù)突樣懸浮細(xì)胞逐漸增多,培養(yǎng)至6d時(shí),懸浮細(xì)胞大量聚集,表面突起伸長(zhǎng),為典型的樹(shù)突狀細(xì)胞。
　　2)表型檢測(cè)
　　CD11c作為小鼠骨髓來(lái)源DC的特異性表面分子,證明小鼠骨髓來(lái)源的單個(gè)核

13、細(xì)胞體經(jīng)外誘導(dǎo)培養(yǎng)可獲得較高純度的DC。本研究結(jié)果顯示,DC表面CD11c的表達(dá)量達(dá)(83.7±1.8)%。
　　2.2 TGF-β對(duì)DC表面CD40、CD83、CD86和MHCⅡ表達(dá)的影響
　　與對(duì)照組DC相比,TGF-β-DC表面CD40、CD83、CD86和MHCⅡ表達(dá)明顯下調(diào)。
　　2.3 TGF-β對(duì)DC中CD45RB和IDO表達(dá)的影響
　　與對(duì)照組DC相比,TGF-β-DC中CD45RB表達(dá)增加,ID

14、O表達(dá)也顯著增加。
　　2.4 TGF-β對(duì)DC分泌IL-10和IL-12的影響
　　為了進(jìn)一步探討TGF-β對(duì)DC免疫力的影響,我們采用ELISA法檢測(cè)DC培養(yǎng)上清中IL-10和IL-12水平。結(jié)果顯示,與對(duì)照組DC培養(yǎng)上清相比,TGF-β-DC上清液中IL-10水平明顯升高,IL-12水平下降。
　　2.5 TGF-β對(duì)DC抗原攝取能力的影響
　　培養(yǎng)6 d的DC為未成熟DC(imDC),90 min內(nèi)對(duì)FI

15、TC-Dextran有較強(qiáng)的攝取率。TGF-β誘導(dǎo)后,DC對(duì)抗原的攝取能力增加。
　　2.6 TGF-β對(duì)DC刺激T細(xì)胞增殖功能的影響
　　將培養(yǎng)6 d的DC與小鼠脾臟來(lái)源的T淋巴細(xì)胞共培養(yǎng)48 h,DC表現(xiàn)出較強(qiáng)的促進(jìn)T細(xì)胞增殖能力。TGF-β誘導(dǎo)后,DC刺激T細(xì)胞增殖的能力顯著下降。
　　3 TGF-β誘導(dǎo)Hepa免疫逃逸的分子機(jī)制
　　3.1 TGF-β上調(diào)DC表面PD-L1表達(dá)
　　分別在DC培養(yǎng)的

16、d3,d4和d5加入TGF-β(10 ng/ml),d6流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)其表面PD-L1的表達(dá)水平。結(jié)果顯示,TGF-β上調(diào)了DC表面PD-L1表達(dá)。
　　為了進(jìn)一步觀察TGF-β對(duì)DC表面PD-L1表達(dá)的影響,我們進(jìn)行了濃度依賴性試驗(yàn),即在DC培養(yǎng)的d4分別加入5 ng/ml,10 ng/ml和20 ng/ml的TGF-β,d6流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)其表面PD-L1的表達(dá)水平。結(jié)果顯示,5 ng/ml,10 ng/ml和20 ng/ml的

17、TGF-β均能上調(diào)DC表面PD-L1的表達(dá)。
　　3.2 TGF-β上調(diào)DC中STAT3和p-STAT3表達(dá)
　　STAT3廣泛的表達(dá)于機(jī)體各組織細(xì)胞并且能被生長(zhǎng)因子活化,因此我們也評(píng)價(jià)了TGF-β對(duì)DC中STAT3和p-STAT3表達(dá)的影響。結(jié)果顯示,分別于DC培養(yǎng)的d3,d4和d5加入TGF-β(10 ng/ml)均能上調(diào)其STAT3和p-STAT3的表達(dá)水平,尤其在d4。同時(shí),我們進(jìn)行了濃度依賴性試驗(yàn),結(jié)果顯示,5 n

18、g/ml,10 ng/ml和20 ng/ml的TGF-β均能上調(diào)DC中STAT3和p-STAT3表達(dá)。
　　3.3 STAT3特異性阻斷劑NSC74859作用后,DC表面PD-L1表達(dá)的變化
　　為了進(jìn)一步探討DC表面PD-L1表達(dá)的分子機(jī)制,我們進(jìn)行了阻斷性試驗(yàn),即在DC培養(yǎng)的d4加入NSC74859(100μM),d6流式細(xì)胞術(shù)及Western blot法檢測(cè)其表面PD-L1的表達(dá)水平。結(jié)果顯示,與對(duì)照組DC相比,TGF

19、-β-DC表面PD-L1表達(dá)增加,加入NSC74859后,PD-L1表達(dá)顯著下降。
　　3.4 TGF-β-DC誘導(dǎo)T細(xì)胞凋亡
　　流式結(jié)果顯示,與對(duì)照組DC相比,TGF-β-DC(10 ng/ml和20 ng/ml TGF-β)誘導(dǎo)了T細(xì)胞凋亡。
　　3.5 TGF-β-DC誘導(dǎo)CD4+CD25+Foxp3+Treg生成
　　我們還觀察了 TGF-β-DC對(duì)誘導(dǎo) Treg生成的影響。結(jié)果顯示,與對(duì)照組 DC相比

20、,TGF-β-DC(5 ng/ml,10 ng/ml和20 ng/ml TGF-β)誘導(dǎo)了CD4+CD25+Foxp3+Treg生成。
　　3.6 TGF-β-DC抑制了T細(xì)胞對(duì)Hepa的殺傷作用
　　DC作為體內(nèi)功能最強(qiáng)大的APC,在T細(xì)胞介導(dǎo)的抗腫瘤免疫應(yīng)答中發(fā)揮著十分重要的作用。以上結(jié)果提示TGF-β可通過(guò)PD-L1/PD-1通路誘導(dǎo)T細(xì)胞無(wú)能。因此,我們進(jìn)一步觀察了與 TGF-β-DC共培養(yǎng)后的T細(xì)胞對(duì)小鼠肝癌細(xì)胞

21、Hepa殺傷作用的變化。結(jié)果顯示,與TGF-β-DC共培養(yǎng)后的T細(xì)胞對(duì)Hepa的殺傷作用明顯減弱。
　　結(jié)論:
　　1.DEN誘導(dǎo)大鼠肝癌模型大致可分為3個(gè)時(shí)期:炎癥損傷期(第4周)、纖維化-硬化期(第12周)和癌變期(第16周)。在這三個(gè)期,模型組大鼠 TGF-β水平和Treg比例顯著升高,且隨著病程的進(jìn)展不斷升高;在炎癥損傷期,模型組大鼠DC表面CD80和CD86表達(dá)無(wú)顯著變化,MHCⅡ表達(dá)增加;在纖維化-硬化期和癌變期

22、,模型組大鼠 DC表面CD80,CD86和MHCⅡ的表達(dá)均顯著下降。
　　2.TGF-β下調(diào)DC表面共刺激分子(CD40、CD83、CD86和MHCⅡ)表達(dá)、上調(diào)DC中免疫抑制性分子(CD45RB、IDO和PD-L1)表達(dá)、抑制DC活化T細(xì)胞能力、誘導(dǎo)T細(xì)胞凋亡和Treg生成以及抑制T細(xì)胞對(duì)Hepa的殺傷作用。
　　3.TGF-β主要通過(guò)STAT3相關(guān)信號(hào)通路上調(diào) DC表面 PD-L1表達(dá),TGF-β-STAT3-PD-L1