piRABC參與膀胱癌發(fā)生發(fā)展機(jī)制初探.pdf

1、背景:膀胱癌是全世界高發(fā)的惡性腫瘤之一。2012年的數(shù)據(jù)顯示，全球有429，800的膀胱癌新發(fā)病例和165，100的膀胱癌死亡病例，其中男性新發(fā)病例和死亡病例數(shù)約為女性的三倍。膀胱癌在男性中的發(fā)病率位居第六，在腫瘤導(dǎo)致的死亡中位居第九位。而在我國，膀胱癌居男性泌尿生殖系惡性腫瘤發(fā)病率第一位，居中國惡性腫瘤發(fā)病率第八位。而且，隨著我國工業(yè)化、城鎮(zhèn)化和人口老齡化的持續(xù)加速，膀胱癌的發(fā)病率和死亡率均有逐年上升的趨勢。2003-2007年，全國

2、32個(gè)腫瘤登記地區(qū)統(tǒng)計(jì)膀胱癌發(fā)病率在不同地區(qū)和不同性別中均呈上升趨勢，膀胱癌死亡率也有比較明顯的上升趨勢。
　　PIWI蛋白相互作用RNA(PIWI-interacting RNA，piRNA)是一類新發(fā)現(xiàn)的非編碼小RNA，它具有多種重要的生物學(xué)功能，已經(jīng)成為一個(gè)新的研究熱點(diǎn)。piRNA最早是在哺乳動(dòng)物的睪丸組織中發(fā)現(xiàn)的，它的長度一般是24～32個(gè)核苷酸，特異性地與PIWI蛋白結(jié)合發(fā)揮作用。自從piRNA發(fā)現(xiàn)以來，科學(xué)家們對(duì)其研究

3、進(jìn)展迅速，已發(fā)現(xiàn)其在胚胎發(fā)育、生殖干細(xì)胞分化、表觀遺傳學(xué)調(diào)控、維持DNA完整性等方面有重要作用。piRNA作為一類重要的參與生物學(xué)功能調(diào)節(jié)的小分子，人們除了研究其在生殖細(xì)胞系中的功能，也開始關(guān)注其與多種疾病比如癌癥之間的關(guān)聯(lián)。最近已有多篇研究報(bào)道了piRNA與癌癥的發(fā)生發(fā)展有著密切的聯(lián)系，提示了piRNA在參與調(diào)控癌癥發(fā)生發(fā)展中的過程中發(fā)揮了重要的作用。
　　方法:本研究選取三對(duì)膀胱癌組織及其相應(yīng)的癌旁正常組織，用于piRNA芯片

4、研究。采用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(quantitative reversetranscription-polymerase chain reaction, qRT-PCR)技術(shù)驗(yàn)證膀胱癌組織中相關(guān)piRNA的表達(dá)水平。然后設(shè)計(jì)和合成篩選出的piRNA的類似物，并用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)入膀胱癌細(xì)胞中，分別采用CCK-8（Cell Counting Kit8，細(xì)胞增殖檢測試劑盒）實(shí)驗(yàn)、軟瓊脂克隆形成實(shí)驗(yàn)和流式細(xì)胞術(shù)等方法觀察其是否影響膀胱癌細(xì)胞的表型

5、。在此基礎(chǔ)上，通過生物信息學(xué)軟件預(yù)測piRNA潛在的靶基因，并通過熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)檢測相關(guān)piRNA與靶基因3'UTR(untranslated regions，非翻譯區(qū))區(qū)的結(jié)合能力。同時(shí)采用qRT-PCR法，Western blot（免疫印跡實(shí)驗(yàn)）和ELISA（enzyme-linked immunosorbent assay，酶聯(lián)免疫吸附反應(yīng)）檢測piRNA靶基因在膀胱癌組織和膀胱癌患者外周血中的水平。
　　結(jié)果:按照f

6、old change≥2，P≤0.05，篩選得到197個(gè)差異表達(dá)的piRNA(106個(gè)上調(diào)，91個(gè)下調(diào))。在這197個(gè)piRNA中，piR-60152的fold change最大，所以我們選擇piR-60152作為研究對(duì)象。因其與膀胱癌相關(guān)，所以我們命名其為piRABC（piRNA associated with bladder cancer, piRABC）。然后采用qRT-PCR技術(shù)在25對(duì)膀胱癌組織中檢測piRABC的表達(dá)水平，p

7、iRABC在膀胱癌組織中低表達(dá)（P=0.003），和芯片結(jié)果一致。在CCK-8和軟瓊脂克隆形成實(shí)驗(yàn)中，轉(zhuǎn)染piRABC類似物顯著地抑制了膀胱癌細(xì)胞的增殖和克隆形成。流式細(xì)胞術(shù)顯示，轉(zhuǎn)染piRABC類似物顯著增加膀胱癌細(xì)胞的凋亡率。為了進(jìn)一步揭示piRABC影響細(xì)胞增殖的機(jī)制，我們通過生物信息學(xué)預(yù)測其潛在的靶基因一TNFSF4(tumor necrosis factor superfamily member4，腫瘤壞死因子超家族成員4)。