Gadd45b參與TGF-β誘導(dǎo)的足細(xì)胞損傷機(jī)制.pdf

1、局灶節(jié)段性腎小球硬化(focal segmental glomerular sclerosis，F(xiàn)SGS)是兒童和成年人腎病綜合征的常見原因，其發(fā)病率逐年上升。FSGS患者臨床表現(xiàn)為大量蛋白尿，病理表現(xiàn)為足細(xì)胞不同程度的損傷。患者易并發(fā)感染、靜脈血栓以及急性腎損傷，部分患者激素治療效果不理想，進(jìn)展為終末期腎病(endstage renal disease，ESRD)。FSGS足細(xì)胞損傷機(jī)制尚不清楚。因此本研究從足細(xì)胞損傷機(jī)制入手，討論其

2、可能的損傷機(jī)制，以加深對(duì)該疾病的認(rèn)識(shí)。
　　 第一部分、Gadd45b在局灶節(jié)段性腎小球硬化患者腎小球中的表達(dá)以及意義
　　 目的:Gadd45b作為DNA損傷修復(fù)的重要相關(guān)基因家族成員之一，該基因編碼的蛋白Gadd45β是一種酸性核蛋白，它參與細(xì)胞周期停滯、DNA損傷修復(fù)、細(xì)胞生存與凋亡的調(diào)節(jié)，可能參與了FSGS的足細(xì)胞損傷。觀察FSGS患者Gadd45b的表達(dá)分布，有助于加深對(duì)FSGS發(fā)病機(jī)制的認(rèn)識(shí)。明確Gadd45

3、b在FSGS患者腎小球中表達(dá)的變化、定位以及與患者臨床病理指標(biāo)的相關(guān)性。
　　 方法:選取成人FSGS患者37例:門周型(n=3)，細(xì)胞型(n=2)，塌陷性(n=1)，頂部型(n=1)，和經(jīng)典型(n=30)。腎切除癌旁組織(n=8)作為對(duì)照。實(shí)時(shí)定量RT-PCR檢測(cè)FSGS患者腎小球Gadd45b基因表達(dá)的變化。免疫組化法分析腎組織Gadd45β的表達(dá)強(qiáng)度與分布。免疫熒光行腎組織Gadd45β和synaptodin、WT-1雙套

4、染，并采用膠體金免疫電鏡技術(shù)明確Gadd45β在腎小球中的定位。用累積光密度(IOD)來(lái)計(jì)算FSGS患者腎小球Gadd45β的表達(dá)強(qiáng)度，并分析其與臨床病理指標(biāo)的相關(guān)性。
　　 結(jié)果:
　　 (1)實(shí)時(shí)定量RT-PCR結(jié)果顯示FSGS患者腎小球Gadd45b基因表達(dá)顯著高于正常組對(duì)照組(p＜0.05)。
　　 (2)正常對(duì)照組腎小球Gadd45β弱陽(yáng)性。免疫組化半定量結(jié)果顯示，F(xiàn)SGS患者Gadd45β表達(dá)顯著高于

5、正常對(duì)照組(FSGS的IOD:3807.20±2069.80 vs正常對(duì)照組的IOD:979.08±202.82，p＜0.0001)。腎活檢組織切片進(jìn)行免疫熒光套染，發(fā)現(xiàn)Gadd45β與足細(xì)胞特異性的標(biāo)志物synatopodin，WT-1分布有一致的地方;免疫電鏡發(fā)現(xiàn)Gadd45β在足細(xì)胞上表達(dá)。
　　 (3) FSGS患者腎小球Gadd45β表達(dá)與蛋白尿(r=0.667，p＜0.0001)、血肌酐(r=0.3609，p=0.0

6、028)、甘油三酯(r=0.4527，p=0.0049)正相關(guān)，血清白蛋白(r=-0.3713，p=0.0237)負(fù)相關(guān)。
　　 結(jié)論:Gadd45b與足細(xì)胞損傷關(guān)系密切，腎小球Gadd45β表達(dá)上調(diào)介導(dǎo)了蛋白尿的產(chǎn)生。腎小球Gadd45β表達(dá)上調(diào)有助于FSGS病情的判斷。
　　 第二部分、探討Gadd45b參與足細(xì)胞損傷機(jī)制
　　 目的:探討Gadd45b參與足細(xì)胞損傷機(jī)制。
　　 方法:
　　

7、 (1)用5ng/ml TGF-β干預(yù)永生化的人足細(xì)胞不同的時(shí)間(15min、30min、1h、4h、12h、24 h、36h、48h)，實(shí)時(shí)定量RT-PCR檢測(cè)Gadd45b基因表達(dá)，Western blot檢測(cè)Gadd45β、細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路MAPK p38的磷酸化水平、活化的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(cleaved caspase-3)以及足細(xì)胞裂孔隔膜蛋白CD2AP。實(shí)時(shí)細(xì)胞儀分析TGF-β刺激人足細(xì)胞引起細(xì)胞指數(shù)的變化，磷脂酰絲

8、氨酸外翻分析（AnnexinⅤ）法檢測(cè)細(xì)胞凋亡指數(shù)。
　　 (2)質(zhì)粒載體使Gadd45β在人足細(xì)胞中過(guò)表達(dá)以及用shRNA方法使Gadd45β在人足細(xì)胞中低表達(dá)。TGF-β分別刺激高表達(dá)Gadd45β的足細(xì)胞、低表達(dá)Gadd45β的足細(xì)胞以及正常足細(xì)胞，然后用磷脂酰絲氨酸外翻分析(AnnexinⅤ)法檢測(cè)細(xì)胞凋亡指數(shù)。
　　 結(jié)果:實(shí)時(shí)定量RT-PCR結(jié)果顯示5ng/ml TGF-β作用足細(xì)胞使Gadd45b表達(dá)顯著上

9、調(diào)，作用1h最明顯，隨后呈時(shí)間依賴性下降，但TGF-β作用48h后仍然高于對(duì)照組，Western blot進(jìn)一步證實(shí)了RT-PCR的結(jié)果。TGF-β刺激人足細(xì)胞24h后出現(xiàn)足細(xì)胞裂孔膜蛋白CD2AP表達(dá)降低，且48h作用最明顯;TGF-β可激活足細(xì)胞p38、cleaved caspase-3。細(xì)胞實(shí)時(shí)分析顯示:TGF-β刺激人足細(xì)胞24h后開始出現(xiàn)細(xì)胞指數(shù)下降，并隨著時(shí)間增加而該效應(yīng)更加明顯，48h細(xì)胞指數(shù)最低。流式細(xì)胞術(shù)分析發(fā)現(xiàn)TGF

10、-β刺激人足細(xì)胞24h后凋亡開始出現(xiàn)并隨著作用時(shí)間的增加而其凋亡率隨著增加。過(guò)表達(dá)Gadd45β足細(xì)胞凋亡明顯增加（過(guò)表達(dá)組:15.07±1.274％ vs對(duì)照組:4.7±1.136％，P＜0.01），TGF-β刺激過(guò)表達(dá)Gadd45β足細(xì)胞凋亡率顯著大于過(guò)表達(dá)Gadd45β足細(xì)胞組（TGF-β刺激過(guò)表達(dá)組:57.97±2.627％vs過(guò)表達(dá)組:15.07±1.274％，）。低表達(dá)Gadd45β足細(xì)胞未見明顯凋亡(低表達(dá)組:6.533±