HGF調(diào)控TGF-β1誘導(dǎo)的骨骼肌細(xì)胞纖維化轉(zhuǎn)型的作用及機(jī)制.pdf

1、目的：
　　 建立一種高效的骨骼肌細(xì)胞分離培養(yǎng)的方法，并在此基礎(chǔ)上觀察轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(transforminggrowthfactorbeta-1，TGF-β1)誘導(dǎo)的骨骼肌細(xì)胞纖維化轉(zhuǎn)型的作用，探討肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(hepatocytegrowthfactor，HGF)調(diào)控TGF-β1誘導(dǎo)骨骼肌細(xì)胞纖維化轉(zhuǎn)型的作用及機(jī)制，為臨床治療失神經(jīng)喉肌纖維化提供一種新策略和理論依據(jù)。
　　 方法：
　　 1、骨骼肌細(xì)胞

2、的分離和培養(yǎng)
　　 實(shí)驗(yàn)組采用經(jīng)腹主動(dòng)脈Ⅱ型膠原酶灌注法消化骨骼肌，取材C57BL/6小鼠趾長(zhǎng)伸肌，D-Hanks液沖洗后移入試管以Ⅰ型膠原酶和Ⅱ型膠原酶聯(lián)合振蕩消化；對(duì)照組小鼠處死后直接取趾長(zhǎng)伸肌，D-Hanks液沖洗后用Ⅰ型膠原酶振蕩消化，以廣口吸管研磨肌腹使肌細(xì)胞徹底松散。顯微鏡下對(duì)兩種分離方法獲得的骨骼肌細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，各組均選取完整存活的肌細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，不同時(shí)間點(diǎn)觀察存活率。
　　 2、TGF-β1誘導(dǎo)骨骼肌細(xì)胞

3、纖維化轉(zhuǎn)型的作用及機(jī)制
　　 C2C12細(xì)胞以分化培養(yǎng)基誘導(dǎo)融合為肌管，分化培養(yǎng)72小時(shí)后更換培養(yǎng)液為不含血清的DMEM，分別給予不同濃度TGF-β1(Ong/ml，0.1ng/ml，1ng/ml，5.0ng/ml)進(jìn)行干預(yù)，12h后實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)各組CTGF和α-SMA在轉(zhuǎn)錄水平的變化，Westernblot檢測(cè)CTGF和α-SMA在蛋白水平表達(dá)變化。
　　 骨骼肌細(xì)胞分離后培養(yǎng)24小時(shí)，選取存活且狀態(tài)良好的肌

4、細(xì)胞隨機(jī)分成實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)組給予TGF-β1(0.5ng/ml)進(jìn)行干預(yù)。12小時(shí)后實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)各組CTGFmRNA和α-SMAmRNA的變化，Westernblot檢測(cè)CTGF和α-SMA蛋白表達(dá)變化。
　　 3、HGF調(diào)控TGF-β1誘導(dǎo)骨骼肌細(xì)胞纖維化轉(zhuǎn)型的作用及機(jī)制
　　 將分離培養(yǎng)的骨骼肌細(xì)胞隨機(jī)分成三組：①空白對(duì)照組②TGF-β1(0.5ng/ml)誘導(dǎo)組(HGF未干預(yù)組)③HGF(4ng/m

5、l)和TGF-β1(0.5ng/ml)共同干預(yù)組，12小時(shí)后實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)各組CTGFmRNA和α-SMAmRNA的變化，間接免疫熒光法和Westernblot檢測(cè)CTGF和α-SMA蛋白分布和表達(dá)水平。
　　 4、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法
　　 所有實(shí)驗(yàn)結(jié)果數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示。采用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。先進(jìn)行各組方差齊性檢驗(yàn)，符合方差齊性條件，各組間均數(shù)比較采用單因素方差分析(ANOVA)

6、和t檢驗(yàn)；不符合方差齊性條件，采用非參數(shù)檢驗(yàn)。P＜0.05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)果：
　　 1、兩種分離方法獲得的骨骼肌細(xì)胞的數(shù)量、生存率
　　 ×5物鏡下平均每個(gè)視野灌注法獲得的肌細(xì)胞數(shù)為(32.17±2.09)根，研磨法獲得的肌細(xì)胞數(shù)為(10.58±1.15)根，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。24h灌注法肌細(xì)胞存活率是研磨法的3.20倍，48h灌注法肌細(xì)胞存活率是研磨法的2.76倍，72h灌注法肌

7、細(xì)胞存活率是研磨法的2.75倍，各時(shí)間點(diǎn)生存率差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。但灌注法操作時(shí)間比研磨法長(zhǎng)，且膠原酶消耗大，實(shí)驗(yàn)成本高。
　　 2、TGF-β1誘導(dǎo)肌管纖維化轉(zhuǎn)型作用及機(jī)制
　　 不同濃度TGF-β1干預(yù)下，肌管CTGFmRNA表達(dá)量較空白對(duì)照組均增高，在1ng/ml濃度時(shí)表達(dá)量最高為空白對(duì)照組的16.03倍，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；不同濃度TGF-β1干預(yù)下肌管α-SMAmRNA表達(dá)量較空白

8、對(duì)照組均增高，在1ng/ml濃度時(shí)表達(dá)量最高是空白對(duì)照組的4.52倍，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。肌管CTGF蛋白表達(dá)量較空白對(duì)照組均增高，在1ng/ml濃度時(shí)表達(dá)量最高是空白對(duì)照組的1.88倍，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；肌管α-SMA蛋白表達(dá)量較空白對(duì)照組均增高，在1ng/ml濃度時(shí)表達(dá)量最高是空白對(duì)照組的1.59倍，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 3、TGF-β1誘導(dǎo)骨骼肌細(xì)胞纖維化轉(zhuǎn)型的作用及機(jī)制<

9、br>　　 TGF-β1誘導(dǎo)下骨骼肌細(xì)胞CTGFmRNA的表達(dá)是空白對(duì)照組9.55倍，α-SMAmRNA的表達(dá)是空白對(duì)照組26.82倍，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。TGF-β1誘導(dǎo)下骨骼肌細(xì)胞CTGF蛋白的表達(dá)是空白對(duì)照組3.63倍，α-SMA蛋白的表達(dá)是空白對(duì)照組3.38倍，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 4、HGF調(diào)控TGF-β1誘導(dǎo)的骨骼肌細(xì)胞纖維化轉(zhuǎn)型的作用及機(jī)制
　　 HGF干預(yù)后CTGF和α

10、-SMAmRNA的表達(dá)量明顯下降，TGF-β1誘導(dǎo)組(HGF未干預(yù)組)CTGFmRNA表達(dá)量是HGF干預(yù)組6.57倍，TGF-β1誘導(dǎo)組(HGF未干預(yù)組)α-SMAmRNA表達(dá)量是HGF干預(yù)組2.64倍，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。HGF干預(yù)后CTGF和α-SMA蛋白表達(dá)量也下降，TGF-β1誘導(dǎo)組(HGF未干預(yù)組)CTGF蛋白表達(dá)量是HGF干預(yù)組2.21倍，TGF-β1誘導(dǎo)組(HGF未干預(yù)組)α-SMA蛋白表達(dá)量是HGF干預(yù)組1

11、.49倍，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。各組骨骼肌細(xì)胞CTGF和α-SMA免疫熒光均檢測(cè)到陽性信號(hào)，以TGF-β1誘導(dǎo)組(HGF未干預(yù)組)信號(hào)最強(qiáng)，HGF干預(yù)后信號(hào)較TGF-β1誘導(dǎo)組(HGF未干預(yù)組)減弱。
　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)論：
　　 1、采用膠原灌注法獲得骨骼肌細(xì)胞數(shù)量多，存活率高，比原有方法更具優(yōu)勢(shì)。但此法操作時(shí)間長(zhǎng)，流程較繁瑣，需要長(zhǎng)期反復(fù)實(shí)踐摸索。
　　 2、TGF-β1可促進(jìn)骨骼肌細(xì)胞和肌管CTGF、