Mdx小鼠骨骼肌纖維化及Spp1基因表達.pdf

1、目的:Duchenne型肌營養(yǎng)不良(Duchenne muscular dystrophin，DMD)是以進行性、對稱性近端肌肉無力及肌肉萎縮為主要臨床特征，以肌肉纖維變性、壞死及纖維化為主要病理特征的X連鎖隱性遺傳性疾病?；颊咄ǔ?-5歲隱襲起病，常于12歲出現(xiàn)不能行走，于20-30歲死于呼吸道感染和心力衰竭。
　　盡管dystrophin蛋白缺失作為DMD的發(fā)病原因已十分明確，但導(dǎo)致肌肉變性、纖維化的具體機制尚不清楚。纖維化是

2、一種細胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)逐漸沉積、實質(zhì)細胞逐漸減少的病理改變，可發(fā)生于多種不同的器官組織，纖維化的持續(xù)進展可致器官結(jié)構(gòu)破壞、功能減退甚至衰竭。DMD患者肌纖維膜dystrophin蛋白缺失，細胞膜結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，完整性遭到破壞，當受到機械性刺激時，大量鈉離子和鈣離子內(nèi)流。細胞內(nèi)鈉離子濃度升高，造成細胞水腫;而鈣離子進入細胞內(nèi)后，作為第二信使激活炎癥進程的級聯(lián)放大反應(yīng)。同時，炎癥細胞釋放促纖維化因子

3、，促進成纖維細胞增殖、分化為成肌纖維細胞(myofibroblast，MFb)。成纖維細胞和MFb分泌ECM及ECM重塑因子，導(dǎo)致ECM合成和降解失衡，出現(xiàn)纖維化。
　　分泌型焦磷酸蛋白1(Secreted phosphoprotein1，Spp1)是一種具有多種功能的分泌型酸性糖蛋白，又稱骨橋素蛋白(osteopontin，OPN)。OPN作為一種重要的多功能糖蛋白，存在于細胞外基質(zhì)中，由多種組織及細胞合成和分泌，可與纖連蛋白和

4、膠原等基質(zhì)分子結(jié)合影響細胞外基質(zhì)重塑，在梗阻性腎病、心肌梗死、創(chuàng)傷修復(fù)等纖維化過程中均發(fā)揮了重要作用，但目前關(guān)于DMD中Spp1與肌纖維化關(guān)系的研究較少。
　　Mdx小鼠因與人類具有相同的基因遺傳學(xué)基礎(chǔ)，被廣泛應(yīng)用于DMD的相關(guān)研究中。我們的實驗主要關(guān)注于mdx小鼠骨骼肌中纖維化情況，研究纖維化相關(guān)基因在mdx小鼠不同時期的差異表達情況，以及Spp1基因在mdx小鼠及對照鼠中不同時期的表達量變化，進一步探討在mdx小鼠中Spp1與

5、肌纖維化的關(guān)系。
　　方法:選取雄性C57BL/10ScSn-Dmdmdx/JNju鼠為實驗組，選取雄性C57BL/6ScSn小鼠為對照組，根據(jù)年齡分為2周組、4周組、8周組、12周組。每組選取6只，分別用于常規(guī)組織化學(xué)染色、基因芯片檢測及qRT-PCR。以10％水合氯醛(350mg/Kg體重)腹腔注射麻醉，取小鼠股四頭肌，分別進行包埋冰凍處理或直接冰凍處理。通過冰凍切片的常規(guī)染色（HE染色）及馬松(masson)染色觀察骨骼肌纖

6、維化情況;使用基因芯片技術(shù)對mdx小鼠不同時期股四頭肌進行基因表達譜分析，使用qRT-PCR技術(shù)檢測不同時期mdx小鼠及對照鼠股四頭肌Spp1基因表達情況，并應(yīng)用spss13.0對數(shù)據(jù)進行分析。
　　結(jié)果:
　　1、不同時期mdx小鼠肌肉纖維化情況
　　H&E染色及馬松染色顯示mdx小鼠股四頭肌纖維化情況:2周時肌纖維排列緊密，個別肌纖維出現(xiàn)變性，未見明顯的肌再生，無結(jié)締組織增生;4周時，出現(xiàn)肌肉變性壞死與再生，但肌纖

7、維排列仍較緊密，無明顯結(jié)締組織增生;8周時，可見輕微的肌纖維排列疏松，部分小片狀區(qū)域可見輕度結(jié)締組織增生;12周時，結(jié)締組織增生程度較8周稍加重，但仍為小片狀區(qū)域的纖維化。(Fig.1、2)
　　2、Mdx小鼠股四頭肌基因芯片中與纖維化相關(guān)基因的表達情況
　　選取mdx小鼠2周與12周股四頭肌基因表達譜進行對比，取P≤0.05，fold-change值≥+2或≤-2為篩選條件，共篩選出差異表達基因2928個，通過Pathwa

8、y通路分析篩選出與纖維化相關(guān)的基因，部分列于Table1。其中Spp1基因2周與12周相比fold-change值為-15.1354，變化明顯。
　　3、Spp1基因在mdx小鼠及對照鼠骨骼肌不同時期的表達
　　3.1 Spp1在mdx小鼠股四頭肌不同時期表達量比較:8周組較4周組明顯升高，12周組較8周組表達量下降，但仍高于4周組，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　3.2 Spp1在mdx小鼠股四頭肌與對照鼠表達量比較:8