Mdx小鼠骨骼肌纖維化及Spp1基因表達(dá).pdf

1、目的:Duchenne型肌營(yíng)養(yǎng)不良(Duchenne muscular dystrophin，DMD)是以進(jìn)行性、對(duì)稱性近端肌肉無力及肌肉萎縮為主要臨床特征，以肌肉纖維變性、壞死及纖維化為主要病理特征的X連鎖隱性遺傳性疾病。患者通常3-5歲隱襲起病，常于12歲出現(xiàn)不能行走，于20-30歲死于呼吸道感染和心力衰竭。
　　盡管dystrophin蛋白缺失作為DMD的發(fā)病原因已十分明確，但導(dǎo)致肌肉變性、纖維化的具體機(jī)制尚不清楚。纖維化是

2、一種細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)逐漸沉積、實(shí)質(zhì)細(xì)胞逐漸減少的病理改變，可發(fā)生于多種不同的器官組織，纖維化的持續(xù)進(jìn)展可致器官結(jié)構(gòu)破壞、功能減退甚至衰竭。DMD患者肌纖維膜dystrophin蛋白缺失，細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，完整性遭到破壞，當(dāng)受到機(jī)械性刺激時(shí)，大量鈉離子和鈣離子內(nèi)流。細(xì)胞內(nèi)鈉離子濃度升高，造成細(xì)胞水腫;而鈣離子進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)后，作為第二信使激活炎癥進(jìn)程的級(jí)聯(lián)放大反應(yīng)。同時(shí)，炎癥細(xì)胞釋放促纖維化因子

3、，促進(jìn)成纖維細(xì)胞增殖、分化為成肌纖維細(xì)胞(myofibroblast，MFb)。成纖維細(xì)胞和MFb分泌ECM及ECM重塑因子，導(dǎo)致ECM合成和降解失衡，出現(xiàn)纖維化。
　　分泌型焦磷酸蛋白1(Secreted phosphoprotein1，Spp1)是一種具有多種功能的分泌型酸性糖蛋白，又稱骨橋素蛋白(osteopontin，OPN)。OPN作為一種重要的多功能糖蛋白，存在于細(xì)胞外基質(zhì)中，由多種組織及細(xì)胞合成和分泌，可與纖連蛋白和

4、膠原等基質(zhì)分子結(jié)合影響細(xì)胞外基質(zhì)重塑，在梗阻性腎病、心肌梗死、創(chuàng)傷修復(fù)等纖維化過程中均發(fā)揮了重要作用，但目前關(guān)于DMD中Spp1與肌纖維化關(guān)系的研究較少。
　　Mdx小鼠因與人類具有相同的基因遺傳學(xué)基礎(chǔ)，被廣泛應(yīng)用于DMD的相關(guān)研究中。我們的實(shí)驗(yàn)主要關(guān)注于mdx小鼠骨骼肌中纖維化情況，研究纖維化相關(guān)基因在mdx小鼠不同時(shí)期的差異表達(dá)情況，以及Spp1基因在mdx小鼠及對(duì)照鼠中不同時(shí)期的表達(dá)量變化，進(jìn)一步探討在mdx小鼠中Spp1與

5、肌纖維化的關(guān)系。
　　方法:選取雄性C57BL/10ScSn-Dmdmdx/JNju鼠為實(shí)驗(yàn)組，選取雄性C57BL/6ScSn小鼠為對(duì)照組，根據(jù)年齡分為2周組、4周組、8周組、12周組。每組選取6只，分別用于常規(guī)組織化學(xué)染色、基因芯片檢測(cè)及qRT-PCR。以10％水合氯醛(350mg/Kg體重)腹腔注射麻醉，取小鼠股四頭肌，分別進(jìn)行包埋冰凍處理或直接冰凍處理。通過冰凍切片的常規(guī)染色（HE染色）及馬松(masson)染色觀察骨骼肌纖

6、維化情況;使用基因芯片技術(shù)對(duì)mdx小鼠不同時(shí)期股四頭肌進(jìn)行基因表達(dá)譜分析，使用qRT-PCR技術(shù)檢測(cè)不同時(shí)期mdx小鼠及對(duì)照鼠股四頭肌Spp1基因表達(dá)情況，并應(yīng)用spss13.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。
　　結(jié)果:
　　1、不同時(shí)期mdx小鼠肌肉纖維化情況
　　H&E染色及馬松染色顯示mdx小鼠股四頭肌纖維化情況:2周時(shí)肌纖維排列緊密，個(gè)別肌纖維出現(xiàn)變性，未見明顯的肌再生，無結(jié)締組織增生;4周時(shí)，出現(xiàn)肌肉變性壞死與再生，但肌纖

7、維排列仍較緊密，無明顯結(jié)締組織增生;8周時(shí)，可見輕微的肌纖維排列疏松，部分小片狀區(qū)域可見輕度結(jié)締組織增生;12周時(shí)，結(jié)締組織增生程度較8周稍加重，但仍為小片狀區(qū)域的纖維化。(Fig.1、2)
　　2、Mdx小鼠股四頭肌基因芯片中與纖維化相關(guān)基因的表達(dá)情況
　　選取mdx小鼠2周與12周股四頭肌基因表達(dá)譜進(jìn)行對(duì)比，取P≤0.05，fold-change值≥+2或≤-2為篩選條件，共篩選出差異表達(dá)基因2928個(gè)，通過Pathwa

8、y通路分析篩選出與纖維化相關(guān)的基因，部分列于Table1。其中Spp1基因2周與12周相比fold-change值為-15.1354，變化明顯。
　　3、Spp1基因在mdx小鼠及對(duì)照鼠骨骼肌不同時(shí)期的表達(dá)
　　3.1 Spp1在mdx小鼠股四頭肌不同時(shí)期表達(dá)量比較:8周組較4周組明顯升高，12周組較8周組表達(dá)量下降，但仍高于4周組，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　3.2 Spp1在mdx小鼠股四頭肌與對(duì)照鼠表達(dá)量比較:8