Gadd45α-γ在肝細(xì)胞性肝癌中的表達及Gadd45α抑制肝癌細(xì)胞生長的信號通路研究.pdf

1、肝癌是我國常見的嚴(yán)重危害人類生命的惡性腫瘤之一，發(fā)病率在我國的惡性腫瘤中居第二位。其中，肝細(xì)胞性肝癌(hepatocellularcareinoma，HCC)是最主要的組織類型。探討HCC組織中異常表達基因的分子生物學(xué)機制，對于了解其發(fā)生、發(fā)展過程以及輔助診斷和治療，有著重要的理論和實際意義。 Gadd45基因家族是在研究腫瘤發(fā)生，發(fā)展以及轉(zhuǎn)歸過程中新發(fā)現(xiàn)的相關(guān)基因家族，該家族成員主要包括Gadd45α、Gadd45β及Gadd

2、45γ。現(xiàn)有資料表明，該基因家族在細(xì)胞周期調(diào)控過程中發(fā)揮重要作用，但其對人肝癌細(xì)胞HepG2細(xì)胞周期的影響及具體機制尚不清楚，故此，本研究就Gadd45α/γ在HCC組織中的表達及Gadd45α抑制肝癌細(xì)胞生長的信號通路進行了初步探討。 第一部分Gadd45α/γ在肝癌組織中的表達及對人肝癌細(xì)胞HepG2細(xì)胞周期的影響目的：檢測Gadd45α/γ蛋白在肝癌組織中的表達情況，并探討其對人肝癌細(xì)胞HepG2細(xì)胞周期的影響。

3、方法：隨機選取臨床HCC標(biāo)本50例，運用免疫組織化學(xué)方法檢測Gadd45α/γ蛋白在50例肝細(xì)胞性肝癌及癌旁組織中的表達水平并分析相關(guān)臨床意義；體外培養(yǎng)人肝癌HepG2細(xì)胞，分別轉(zhuǎn)染質(zhì)粒pCMV-tag2B、pCMV-tag2B-Gadd45α和pCMV-tag2B-Gadd45γ，運用流式細(xì)胞儀檢測Gadd45α/γ對細(xì)胞周期分布的影響。 結(jié)果： (1)Gadd45α蛋白在50例肝細(xì)胞性肝癌中陽性率為58.0％(29/

4、50)，癌旁組織中陽性率為62.0％(31/50)，兩者差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義；Gadd457蛋白在肝癌組織中的陽性表達率為30.0％(15/50)，而在癌旁組織中的陽性表達率為86.0％(43/50)，兩者比較有顯著性差異(p<0.01)。 (2)Gadd45α/γ蛋白表達陽性率與肝癌分化程度有關(guān)，它們在高分化癌中陽性率(84.2％，57.9％)顯著高于在中低分化癌中的陽性率(41.9％，12.9％)；兩者有顯著性差異(p<0.0

5、5)，而Gadd45α/γ蛋白表達陽性率與性別，年齡以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的相關(guān)性不明顯(p>0.05)。 (3)將質(zhì)粒pCMV-tag2B-Gadd45α/γ分別轉(zhuǎn)染至人肝癌細(xì)胞HepG2后可誘導(dǎo)細(xì)胞周期G2/M期阻滯，且pCMV-tag2B-Gadd45α(G2/M期細(xì)胞比值為0.31±0.03)誘導(dǎo)的阻滯程度較pCMV-tag2B-Gadd457(G2/M期細(xì)胞比值為0.21±0.03)誘導(dǎo)的阻滯程度更為明顯。 結(jié)論：Ga

6、dd45α/γ蛋白的表達可能與肝癌的病理分型、發(fā)展以及轉(zhuǎn)歸過程存在著密切關(guān)系，與Gadd45γ相比，Gadd45α在肝癌的轉(zhuǎn)歸過程中可能扮演著更為重要的角色，并且為肝癌的基因治療提供了新的分子靶點。 第二部分Gadd45α誘導(dǎo)人肝癌細(xì)胞G2/M期阻滯的相關(guān)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路研究目的：探討Gadd45α抑制肝癌細(xì)胞生長可能涉及的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，為研究肝癌細(xì)胞生長抑制性基因提供初步理論依據(jù)。 方法：體外培養(yǎng)人肝癌細(xì)胞HepG2，分別

7、轉(zhuǎn)染質(zhì)粒pCMV-tag2B-Gadd45α和pCMV-tag2B至細(xì)胞，采用western blot方法檢測Gadd45α及其下游基因P38、p-P38、JNK和P-JNK的表達變化；然后，給予信號通路的抑制劑(SB203580和SP600125)分別特異性阻斷P38和JNK的磷酸化，再運用流式細(xì)胞儀檢測并比較各組細(xì)胞周期，進而分析Gadd45α誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞HepG2阻滯在G2/M期可能涉及的信號通路。 結(jié)果： (1)

8、將質(zhì)粒pCMV-tag2B-Gadd45α轉(zhuǎn)染至人肝癌細(xì)胞HepG2 48h后，Gadd45α蛋白表達峰值為0.68±0.02，其下游基NP38(0.94±0.01)和JNK(0.77±0.04)的磷酸化水平與空白對照組(0.58±0.02，0.50±0.02)相比均明顯升高。 (2)運用特異性抑制劑使升高的P38和JNK(磷酸化表達水平降低至0.56±0.02和0.53±0.03，達到空白對照組磷酸化水平(0.58±0.02，