XPD對(duì)SMMC-7721肝癌細(xì)胞中DNp73和GADD45β的調(diào)控及意義.pdf

1、目的:
　　通過(guò)將著色性干皮病D組基因(XPD，xeroderma pigmentosum group D)轉(zhuǎn)染人SMMC-7721肝癌細(xì)胞后，觀察XPD、GADD45β和DNp73基因mRNA和蛋白的表達(dá)變化;以及對(duì)人SMMC-7721肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)和凋亡的影響。
　　方法:
　　1、用含10％胎牛血清的1640培養(yǎng)液培養(yǎng)SMMC-7721肝癌細(xì)胞，并置于37℃、5％CO2的孵箱內(nèi)培養(yǎng)。
　　2、通過(guò)Lipofe

2、ctamine2000進(jìn)行瞬時(shí)轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒pEGFP-N2-XPD、pEGFP-N2至SMMC-7721肝癌細(xì)胞內(nèi)。實(shí)驗(yàn)分四組:XPD組、N2組、脂質(zhì)體組和空白對(duì)照組，轉(zhuǎn)染后在倒置熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染結(jié)果。
　　3、設(shè)計(jì)并化學(xué)合成預(yù)檢測(cè)基因的PCR引物:XPD、DNp73、GADD45β;收集各轉(zhuǎn)染組及空白對(duì)照組SMMC-7721肝癌細(xì)胞，提取RNA并利用RT-PCR檢測(cè)XPD、DNp73、GADD45β在各組細(xì)胞中的RNA表達(dá)水

3、平;用Band Leader3.0圖像分析軟件進(jìn)行灰度分析。
　　4、收集各轉(zhuǎn)染組及空白對(duì)照組SMMC-7721肝癌細(xì)胞，提取蛋白并利用Western blotting檢測(cè)XPD、DNp73、GADD45β在各組細(xì)胞中的蛋白表達(dá)水平;用Quantity One圖像分析軟件進(jìn)行灰度分析。
　　5、利用四甲基偶氮唑鹽(MTT)法檢測(cè)各組細(xì)胞的細(xì)胞增殖力。
　　6、利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡率:四組細(xì)胞經(jīng)0.25％胰酶消

4、化后采用Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測(cè)。
　　7、運(yùn)用SPSS13.0進(jìn)行分析，用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示資料，單因素方差分析用于組間比較，LSD檢驗(yàn)用于兩兩比較。
　　結(jié)果:
　　1、轉(zhuǎn)染:顯微鏡下見(jiàn)N2組和XPD組的細(xì)胞中有綠色熒光蛋白(GFP)的表達(dá)，然而空白組和脂質(zhì)體組的細(xì)胞則未見(jiàn)表達(dá)。
　　2、RT-PCR檢測(cè):XPD組細(xì)胞內(nèi)XPD和GADD45β的mRNA表達(dá)量均高于其他三組

5、，而DNp73的mRNA表達(dá)量低于其他三組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。XPD、GADD45β和DNp73的mRNAs表達(dá)量在N2組、脂質(zhì)體組和空白對(duì)照組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。
　　3、Western blotting檢測(cè): XPD組細(xì)胞內(nèi)XPD和GADD45β的蛋白表達(dá)量高于其他三組，DNp73的蛋白表達(dá)量低于其他三組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。XPD、GADD45β和DNp73的蛋白表達(dá)水平在N2

6、組、脂質(zhì)體組和對(duì)照組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。
　　4、MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖活力:XPD組的細(xì)胞增殖力明顯低于其他三組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。
　　5、流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率:轉(zhuǎn)染pEGFP-N2-XPD重組質(zhì)粒的細(xì)胞凋亡較其他三組顯著，凋亡達(dá)56.53％，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。
　　結(jié)論:
　　XPD具有抑制人肝癌細(xì)胞增殖和促進(jìn)其凋亡的作用，其作用機(jī)制之一是通過(guò)抑制癌基因和