HCV NS5A下調(diào)抑癌基因GADD45α和PTEN的分子機(jī)制及其生物學(xué)影響.pdf

1、H背景和目的:丙型肝炎病毒(hepatitis C virus，HCV)非結(jié)構(gòu)蛋5A(non-structural5A，NS5A)作為HCV的非結(jié)構(gòu)蛋白之一，具有重要的生物學(xué)功能。NS5A蛋白參與HCV病毒復(fù)制、細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、促進(jìn)細(xì)胞增殖、抵抗細(xì)胞凋亡等細(xì)胞生命活動(dòng)，與原發(fā)性肝癌(hepatocellular carcinoma，HCC)的發(fā)生關(guān)系密切。HCV NS5A可能通過(guò)調(diào)節(jié)宿主細(xì)胞的蛋白表達(dá)而致病。生長(zhǎng)阻滯和DNA損傷45α基因

2、(Growth arrest and DNA damage45-alpha,GADD45α)作為一個(gè)腫瘤抑制基因，參與細(xì)胞周期調(diào)控阻滯和生長(zhǎng)抑制，維持細(xì)胞基因組穩(wěn)定，在維持正常的細(xì)胞周期中發(fā)揮重要功能。第十號(hào)染色體同源丟失性磷酸酶張力蛋白基因(phosphatase and tensinhomolog deleted in chromosome10，PTEN)作為另一種重要的腫瘤抑制基因，通過(guò)對(duì)細(xì)胞內(nèi)多條信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的負(fù)性調(diào)控，抑制腫瘤

3、細(xì)胞的增殖、遷移、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，維持細(xì)胞生長(zhǎng)動(dòng)態(tài)平衡。既往臨床研究發(fā)現(xiàn)，原發(fā)性肝癌患者肝癌細(xì)胞GADD45α和PTEN表達(dá)較正常肝細(xì)胞均明顯降低，提示GADD45α和PTEN與原發(fā)性肝癌的發(fā)生密切相關(guān)。HCV作為原發(fā)性肝癌的主要致病因素之一，其誘導(dǎo)肝癌發(fā)生的機(jī)制仍不十分清楚。在本課題中，我們研究HCVNS5A對(duì)GADD45α和PTEN表達(dá)的影響及調(diào)控機(jī)制，進(jìn)而探討GADD45α和PTEN表達(dá)異常對(duì)HCV感染的肝癌細(xì)胞增殖和凋亡的影響

4、，旨在為HCV感染誘發(fā)肝癌提供新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　方法:分別使用熒光素酶試驗(yàn)，相對(duì)定量RT-PCR和免疫蛋白印跡檢測(cè)HCV NS5A對(duì)GADD45α和PTEN啟動(dòng)子活性、mRNA轉(zhuǎn)錄、和蛋白表達(dá)影響。通過(guò)p53過(guò)表達(dá)或針對(duì)p53、NF-κB、和PI3K的小分子RNA干擾技術(shù)(small interfering RNAs，siRNAs)，研究HCV NS5A對(duì)GADD45α表達(dá)的調(diào)控機(jī)制。此外，通過(guò)細(xì)胞活性試驗(yàn)和克隆形成實(shí)驗(yàn)評(píng)估GA

5、DD45α沉默或GADD45α過(guò)表達(dá)對(duì)肝癌細(xì)胞增殖活性的影響。同樣，使用小分子化學(xué)抑制劑和小分子RNA干擾技術(shù)探索HCV NS5A對(duì)PTEN表達(dá)調(diào)控的機(jī)制。最后，通過(guò)Caspase3/7活性試驗(yàn)和凋亡蛋白評(píng)估肝癌細(xì)胞在PTEN過(guò)表達(dá)和Akt活化抑制下的細(xì)胞凋亡。
　　結(jié)果:HCVNS5A在轉(zhuǎn)錄水平，通過(guò)下調(diào)GADD45α啟動(dòng)子活性，mRNA轉(zhuǎn)錄，繼而下調(diào)GADD45α蛋白表達(dá)。P53沉默能使GADD45α表達(dá)下調(diào)，而p53過(guò)表達(dá)能

6、廢除HCV NS5A對(duì)GADD45α的下調(diào)作用。HCV NS5A下調(diào)P53表達(dá)，繼而導(dǎo)致下游GADD45α表達(dá)降低。進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明HCVNS5A促進(jìn)NF-κB和Akt磷酸化。使用針對(duì)NF-κB和PI3K-Akt的小分子抑制劑或特異性siRNAs，能抵消HCVNS5A對(duì)p53和GADD45α的下調(diào)作用。另外，HCV NS5A蛋白通過(guò)抑制P53進(jìn)而下調(diào)GADD45α蛋白表達(dá)，促進(jìn)肝癌細(xì)胞增殖、生長(zhǎng)。而GADD45α過(guò)表達(dá)抑制HCVNS5

7、A誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖。同樣發(fā)現(xiàn)，HCV在轉(zhuǎn)錄水平，下調(diào)PTEN啟動(dòng)子活性，mRNA轉(zhuǎn)錄，和PTEN蛋白表達(dá)。NS5A蛋白在HCV成熟蛋白中對(duì)PTEN下調(diào)作用最顯著。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)HCV NS5A通過(guò)ROS途徑促進(jìn)NF-κB磷酸化及非ROS途徑激活PI3K-Akt磷酸化抑制PTEN蛋白表達(dá)。使用小分子抑制劑和siRNAs抑制NF-κB和PI3K-Akt通路，能廢除HCVNS5A對(duì)PTEN的下調(diào)。此外，PTEN過(guò)表達(dá)能拮抗PI3K對(duì)Akt的活化