NS5A基因在HCV復制和感染中的作用及16S rDNA用于血液微生物快速篩查研究.pdf

1、本研究對JFH1 NS5A蛋白在病毒復制和感染中的作用進行了研究。首先建立J6JFH1 (HCV 2a J6的core-NS2與JFH1 NS2-3'UTR組成的2a/2a嵌合體)的體外細胞模型,并在原核和真核細胞中表達NS5A蛋白；通過基因置換的方法構(gòu)建全長基因型間的嵌合基因組,通過比較嵌合體與野生型基因組的復制效率和產(chǎn)生細胞培養(yǎng)產(chǎn)生的HCV(cell culture produced HCV,HCVcc)的能力,探討了NS5A在JF

2、H1株體外高效復制和感染中發(fā)揮的作用。此外,本研究還對多種微生物16S rDNAs的序列比對與進化樹進行分析,設(shè)計、合成了微生物通用及特異性引物,初步建立了基于16S rDNAs的快速篩檢血液及血液制品中微生物污染的熒光定量PCR(fluorescence quantitative PCR,FQ-PCR)方法。 一、HCV 2a FL-J6JFH細胞感染模型的建立 全長HCV 2a型基因組FL-J6JFH和復制缺陷型陰性

3、對照FL-J6JFH(GND)線性化后體外轉(zhuǎn)錄成RNA,脂質(zhì)體介導轉(zhuǎn)染Huh-7.5細胞。抽提細胞總RNA,逆轉(zhuǎn)錄成cDNA后作為模板,以HCV特異的熒光定量PCR(FQ RT-PCR)檢測轉(zhuǎn)染細胞內(nèi)HCV RNA水平。轉(zhuǎn)染后第5天,FL-J6JFH轉(zhuǎn)染細胞內(nèi)HCV RNA為1.2×106GE/μg RNA,在第9天,下降到最低水平6.9×105GE/μg RNA：在13天,上升到最高值6.5×106GE/μg RNA。此后直至第59天

4、,細胞內(nèi)RNA水平保持在106 GE/μg RNA。與之相對,陰性對照FL-J6JFH(GND)轉(zhuǎn)染細胞后HCVRNA很快消失。以丙型肝炎患者血清為抗體,免疫熒光染色觀察轉(zhuǎn)染細胞內(nèi)HCV蛋白表達。結(jié)果顯示第5天至第59天,FL-J6JFH轉(zhuǎn)染的細胞內(nèi)可以檢測到HCV蛋白表達,而FL-J6JFH(GND)轉(zhuǎn)染和FL-J6JFH轉(zhuǎn)染以正常人血清檢測的細胞內(nèi)都未觀察到HCV蛋白陽性細胞。上述結(jié)果表明,轉(zhuǎn)染的FL-J6JFH可以在Huh-7.5

5、細胞內(nèi)長時間有效復制。收集轉(zhuǎn)染細胞上清感染naive Huh-7.5細胞,3天后免疫熒光法檢測HCV蛋白陽性細胞。從第5天開始收集的各個時間點的FL-J6JFH轉(zhuǎn)染細胞的上清,感染細胞后都可見HCV蛋白表達。由此可見,全長2a型基因組FL-J6JFH轉(zhuǎn)染細胞后,能夠產(chǎn)生具有感染性的病毒顆粒(HCVcc)。該細胞感染模型的建立為研究HCV各基因結(jié)構(gòu)在病毒復制和HCVcc包裝成熟中的作用提供了實驗平臺。 二、JFH1 NS5A蛋白的

6、表達與鑒定 PCR特異擴增JFH1 NS5A基因,克隆入pET-32a和pEGFP-N1載體,構(gòu)建JFH1 NS5A的原核和真核重組表達質(zhì)粒pET-JFH1 NS5A和pEGFP-JFH1 NS5A。將pET-JFH1 NS5A轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3),pEGFP-JFH1 NS5A轉(zhuǎn)染HEK 293T細胞,在原核與真核系統(tǒng)中進行表達,以SDS-PAGE、熒光顯微術(shù)和Western blotting方法檢測目的蛋白的表達。

7、SDS-PAGE電泳檢測到融合蛋白在原核細胞中的表達,熒光顯微鏡觀察、Western blotting檢測證實了EGFP-JFH1 NS5A融合蛋白在HEK 293T細胞中表達。利用PubMed BLAST軟件對JFH1與HCV1a、1b、2b和2c型NS5A蛋白間的同源性進行分析。BLAST分析顯示,JFH1和H77、HC-J4、HCV-J8和BEBE1病毒株NS5A蛋白的同源性分別為57％、60％、68％和74％。JFH1 NS5A

8、蛋白在原核與真核細胞中表達成功,為研究HCV NS5A在JFH1株復制中的作用、NS5A與病毒其它蛋白以及宿主蛋白間的相互作用提供了材料。 三、JFH1 NS5A基因置換對FL-J6JFH病毒復制和感染性的影響 采用重疊延伸PCR方法聯(lián)合酶切反應(yīng),用我國HCV感染最常見的基因型(1b型HC-J4株)的NS5A替換了FL-J6JFH的相應(yīng)基因,構(gòu)建基因型間嵌合體FL-J6JFH/J4NS5A。將其和野生型FL-J6JFH體

9、外轉(zhuǎn)錄后分別轉(zhuǎn)染Huh-7.5細胞。FQ RT-PCR比較二者轉(zhuǎn)染細胞在培養(yǎng)過程中HCV RNA水平差異。結(jié)果顯示,嵌合體的復制動力學較野生型明顯減緩。在第9天后的任一時間點,嵌合體轉(zhuǎn)染細胞內(nèi)HCV RNA水平都顯著低于野生型轉(zhuǎn)染細胞(p<0.05)。在第34天,嵌合體轉(zhuǎn)染細胞內(nèi)HCV RNA水平最高,達5.6±1.8×104 GE/μg RNA,比野生型轉(zhuǎn)染細胞的最高值低126倍(第13天,p<0.05)。用免疫熒光染色和Wester

10、n blotting檢測轉(zhuǎn)染細胞內(nèi)HCV蛋白表達情況：在第9天后的各個時間點,嵌合體和野生型FL-J6JFH轉(zhuǎn)染組在熒光顯微鏡下都觀察到了HCV蛋白陽性細胞。在第9天,裂解野生型轉(zhuǎn)染細胞Western blotting檢測到了NS5A蛋白,而嵌合體轉(zhuǎn)染細胞未檢測到。在第13天和59天,嵌合體轉(zhuǎn)染細胞內(nèi)也可以檢測到NS5A蛋白,但表達量明顯少于野生型轉(zhuǎn)染細胞。收集細胞上清,梯度稀釋后感染naive Huh-7.5細胞,測定轉(zhuǎn)染細胞上清的感

11、染滴度。發(fā)現(xiàn)嵌合體轉(zhuǎn)染細胞上清HCVcc滴度顯著低于相同時間點的野生型細胞上清(p<0.05),上清感染性滴度最高為78.3±23.6 ffu/ml,低于野生型上清最高值300倍(p<0.05)。此外,還觀察到了嵌合體和野生型FL-J6JFH轉(zhuǎn)染細胞后所致細胞病變效應(yīng),自第13天開始,野生型FL-J6JFH轉(zhuǎn)染細胞培養(yǎng)物中持續(xù)出現(xiàn)大量不貼壁的細胞,細胞生長緩慢并大量死亡。13天以后,野生型轉(zhuǎn)染細胞內(nèi)病毒RNA和釋放到上清中的HCVcc量

12、均達到最大值并維持較高水平。與之相對,嵌合體轉(zhuǎn)染細胞一直未觀察到細胞病變效應(yīng)。 四、JFH1 NS5A基因?qū)C-J4株病毒復制和感染性的影響 將JFH1 NS5A置換至HC-J4基因組內(nèi),構(gòu)建嵌合全長基因組HC-J4/JFHNS5A。將嵌合體和野生型HC-J4的RNA轉(zhuǎn)錄體分別轉(zhuǎn)染Huh-7.5細胞,用免疫熒光染色和HCV負鏈RNA特異性RT-PCR法檢測二者在轉(zhuǎn)染細胞內(nèi)的蛋白表達和基因復制情況。免疫熒光染色未觀察到H

13、CV蛋白在轉(zhuǎn)染了嵌合體和野生型HC-J4細胞內(nèi)的表達,但在轉(zhuǎn)染18天以內(nèi)的各個時間點,轉(zhuǎn)染細胞內(nèi)都檢測到了HCV負鏈RNA。表明嵌合體和野生型HC-J4在轉(zhuǎn)染細胞內(nèi)呈低水平復制。FQ RT-PCR比較轉(zhuǎn)染細胞中HCV RNA水平。轉(zhuǎn)染后第9天和第12天,嵌合體轉(zhuǎn)染細胞內(nèi)HCV RNA水平高于野生型轉(zhuǎn)染的細胞(p<0.05)。但與陽性對照FL-J6JFH相比,一段時間后轉(zhuǎn)染細胞內(nèi)的HCV即被宿主細胞清除。 五、基于16S rDNA

14、s的血液微生物污染快速檢測研究 對20余種常見致病細菌的16S rDNAs進行多序列比對,設(shè)計擴增細菌16S rDNAs的FQ-PCR通用引物。以12種常見致病細菌、2種真菌、1種支原體、1種病毒和人基因組DNA為模板,驗證通用引物檢測細菌的特異性。以通用引物擴增金黃色葡萄球菌16S rDNA靶片段,構(gòu)建標準質(zhì)粒pMDT-Bfr,并建立FQ-PCR定量標準曲線。分別以金黃色葡萄球菌和大腸埃希菌作為革蘭陽性和革蘭陰性細菌代表菌,以

15、其不同濃度的DNA為模板進行FQ-PCR反應(yīng),檢驗該方法的敏感性。抽提梯度稀釋的金黃色葡萄球菌和大腸埃希菌模擬血液細菌污染標本的總DNA作為FQ-PCR反應(yīng)模板,檢驗基于16S rDNAs的FQ-PCR作為血液細菌污染檢測方法的敏感性。 小結(jié)： 1.建立了HCV 2a型FL-J6JFH的Huh-7.5細胞感染模型,能夠高效自主復制并產(chǎn)生感染性病毒顆粒(HCVcc),為進行HCV各基因結(jié)構(gòu)功能的研究提供了實驗平臺。

16、 2.用HCV 1b型HC-J4株的NS5A置換FL-J6JFH的相應(yīng)基因,構(gòu)建了基因型間嵌合體FL-J6JFH/J4NS5A。與野生型相比,嵌合體在體外復制效率明顯降低,HCVcc產(chǎn)量顯著減少。將JFH1 NS5A置換至HC-J4基因組內(nèi),在一定程度上提高了HC-J4 RNA的體外復制水平。表明NS5A在JFH1株高效復制中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。 3.基因型間嵌合體FL-J6JFH/J4NS5A產(chǎn)生的病毒產(chǎn)物和感染性顆粒遠低于野生型