男性不育相關(guān)基因在精液中的篩查及分析.pdf

1、目的：
　　 全世界約有10-15%的夫妻受到不育癥的困擾,男性因素約占50%。越來(lái)越多的證據(jù)表明,不育癥的發(fā)生與遺傳因素相關(guān)。所以,對(duì)男性不育相關(guān)基因進(jìn)行篩查,并對(duì)其引發(fā)不育癥的機(jī)制進(jìn)行探索是十分必要的。目前,在基因表達(dá)水平對(duì)男性不育癥進(jìn)行分析,通常需要獲得患者的睪丸組織。睪丸活檢是一種有創(chuàng)手術(shù),應(yīng)用于對(duì)無(wú)精患者的診斷與治療中(檢測(cè)睪丸內(nèi)是否存在精子,行取精術(shù)利用輔助生殖技術(shù)孕育后代),正常人及大多數(shù)男性不育患者的睪丸組織不易

2、獲得。不育患者精液中精子過(guò)少或沒(méi)有精子,以及精子內(nèi)的基因表達(dá)不能代表全睪丸內(nèi)的基因表達(dá)情況是精液遺傳學(xué)檢測(cè)被忽視的原因。我們推測(cè),精液中除含有精子外,還存在著其它類型睪丸細(xì)胞及這些細(xì)胞的基因表達(dá)信息。在沒(méi)有睪丸組織的情況下,以精液為樣本進(jìn)行相關(guān)基因的檢測(cè)也可以對(duì)睪丸內(nèi)的基因表達(dá)情況有一個(gè)較為全面的了解。本研究旨在利用無(wú)創(chuàng)取材樣本對(duì)男性不育相關(guān)基因進(jìn)行篩查,對(duì)不育癥發(fā)生機(jī)制進(jìn)行探索,同時(shí)亦為無(wú)精癥患者的無(wú)創(chuàng)診斷提供依據(jù)。
　　 方

3、法：
　　 在前期研究工作獲得的“339個(gè)小鼠睪丸特異表達(dá)基因”基礎(chǔ)上,選擇在人體中表達(dá)特異性強(qiáng)且豐度高的各類型睪丸細(xì)胞標(biāo)志基因作為候選基因,共80個(gè)。提取2例正常男性睪丸RNA,反轉(zhuǎn)為cDNA,分別稀釋為1/10、1/100和1/1000倍后,檢測(cè)各候選基因的表達(dá)。2例正常男性任-1/1000倍cDNA組檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性,即可認(rèn)為該候選基因檢驗(yàn)敏感性良好,選擇這些基因進(jìn)行下一步檢測(cè)。分別提取正常人精液沉淀和上清兩部分RNA,反轉(zhuǎn)

4、為cDNA后,PCR方法檢測(cè)上一步獲得的檢驗(yàn)敏感性好的基因的表達(dá),篩選出沉淀和上清中表達(dá)頻率均大于50%的高頻基因。分別提取弱精患者、無(wú)精患者精液沉淀和上清RNA,反轉(zhuǎn)錄為cDNA,檢測(cè)弱精患者、無(wú)精患者精液沉淀和上清中高頻基因的表達(dá)。利用SPSS17.0軟件分析高頻基因在正常人、弱精患者和無(wú)精患者精液中的表達(dá)是否存在差異,并比較高頻基因在所有精液樣本沉淀、上清、全精液(沉淀+上清)中的檢測(cè)結(jié)果,同時(shí),對(duì)高頻基因在精液沉淀和上清中的檢測(cè)

5、結(jié)果的一致性程度進(jìn)行分析。
　　 結(jié)果：
　　 1、Kitlg、Akap4在弱精患者精液中表達(dá)頻率下調(diào),Akap4,Tnp1、Spata3,Prm1、Prm2在無(wú)精患者精液中表達(dá)頻率下調(diào)。
　　 2、部分精液樣本上清檢測(cè)結(jié)果對(duì)沉淀檢測(cè)結(jié)果有“補(bǔ)償”作用,高頻基因在全精液中檢測(cè)的檢出率明顯高于僅在精液沉淀或上清中檢測(cè)。
　　 3、Pou5f1等8個(gè)高頻基因在精液沉淀和上清中檢驗(yàn)一致性較高,Sbf1基因在正常