從不育男性精液中磁性篩選非凋亡精子的初步研究.pdf

1、目的：
　　據(jù)統(tǒng)計(jì)不育癥的發(fā)病率在10％-15％左右，而男性因素在不育癥病因中所占的比例已接近50％左右，且有逐年增加的趨勢(shì)。輔助生殖技術(shù)(ART)已經(jīng)成為不育癥治療的首要方法，但是成功率并沒有達(dá)到的較高的水平，原因之一是精子的質(zhì)量低下。精子優(yōu)選是ART過程中的必要步驟，能有效提高ART的臨床妊娠率，常用的方法有上游法，密度梯度離心法，玻璃纖維過濾法等，可以使死精子、畸形精子及白細(xì)胞等有害物質(zhì)中分離出來(lái)，優(yōu)選出活動(dòng)力高，形態(tài)好的精

2、子。精子活動(dòng)力和形態(tài)一直被人們所關(guān)注，然而不可見的精子異常經(jīng)常被忽視，如精子凋亡，主要特點(diǎn)為精子細(xì)胞膜上磷脂酰絲氨酸(PS)外翻，線粒體膜電位完整性破壞，caspase-3激活以及DNA損傷。成功的受精需要精子細(xì)胞的完整性，凋亡破壞了細(xì)胞膜的和DNA的完整性，影響了男性的生殖能力。磁性活細(xì)胞分選技術(shù)(MACS)是一種方便、快速、簡(jiǎn)單的基于細(xì)胞表面標(biāo)志物的分選方法。該技術(shù)是利用藕聯(lián)有膜聯(lián)蛋白Ⅴ的超順磁珠與PS外翻的精子免疫性結(jié)合，這樣把精

3、子分成2部分，一部分是膜聯(lián)蛋白Ⅴ陰性的精子（細(xì)胞膜完整，未凋亡的精子），一部分是膜聯(lián)蛋白Ⅴ陽(yáng)性的精子（PS外翻，凋亡的精子）。膜聯(lián)蛋白Ⅴ陽(yáng)性的精子因?yàn)榇艌?chǎng)力的作用而吸附在分選柱上而膜聯(lián)蛋白Ⅴ陰性的精子順利流下來(lái)。DGC利用離心力的作用優(yōu)選精子，是一種常用的方法。MACS技術(shù)能有效去除死精子和凋亡的精子，獲得活力高、形態(tài)好的、細(xì)胞膜和DNA完整的精子，對(duì)精子的損傷小。本研究通過對(duì)30例不育癥男性的精液標(biāo)本分別進(jìn)行MACS和DGC處理，然后

4、對(duì)優(yōu)選后的精子進(jìn)行活性caspase-3檢測(cè)和TUNEL分析計(jì)算凋亡率，評(píng)價(jià)MACS技術(shù)對(duì)不育癥男性的精子的優(yōu)選作用。
　　方法：
　　研究對(duì)象為2011年12月-2012年6月期間本中心不育癥男性患者30例，患者婚后同居一年以上，在未采取任何避孕措施及性生活正常的情況下不育。患者經(jīng)體檢未發(fā)現(xiàn)患者具有明顯的睪丸、附睪、輸精管等異常，并排除家族史、性病史、性功能障礙等?；颊呦冉?-7天，參照世界衛(wèi)生組織制定少精子癥的標(biāo)準(zhǔn)，精

5、液密度需＜20×106/ml，射出的精液收集后置于37℃水浴箱中液化時(shí)間15-30分鐘，在精液液化后用Malker計(jì)數(shù)板分析精子的密度和活動(dòng)度，然后將液化的精液分成三份，一份做control組行空白對(duì)照，另外西份分別行MACS處理和DGC處理。然后這三份精液分別用FLICA技術(shù)檢測(cè)活性的caspase-3，用TUNEL分析DNA斷裂情況，在熒光顯微鏡下根據(jù)顯色反應(yīng)分別計(jì)算陽(yáng)性率。
　　結(jié)果：
　　1.本研究中選取了本生殖中心

6、不育癥男性患者30例，其中少精癥患者15例，少弱精癥患者15例，年齡27～39歲，平均年齡為(31.4±1.9)歲，平均密度為(7.57±2.39)×106/ml，精子活動(dòng)力a級(jí)為(17.41±11.98)％，精子活力a+b為(44.79±15.71)％。
　　2.活性caspase-3檢測(cè)結(jié)果:本研究根據(jù)精子優(yōu)選方法分為Control組，DGC組和MACS組，經(jīng)過處理后獲得的精子做活性caspase-3檢測(cè)計(jì)算凋亡率，Contr

7、ol組、DGC組和MACS組的凋亡率分別是16.23％±4.59％、10.16％±0.80％、5.21％±0.46％，其中MACS組的凋亡率低于Control組和DGC組，DGC組凋亡率低于Control組，均存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，且P＜0.05。
　　3.TUNEL檢測(cè)結(jié)果:經(jīng)過處理后獲得精子做TUNEL分析，Control組、DGC組和MACS組的凋亡率分別是19.69％±6.32％、11.29％±5.03％、6.82％±3.28％

8、，其中MACS組的凋亡率低于Control組和DGC組，DGC組凋亡率低于Control組，均存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，且P＜0.05。
　　4.Control組，DGC組和MACS組中少精癥患者caspase-3檢測(cè)的凋亡率PAS分別是14.55％±4.67％、8.67％±3.77％、4.69％±2.34％，TUNEL分析獲得的凋亡率分別是19.58％±7.65％，11.85％±6.31％，7.29％±3.92％。兩種方法檢測(cè)的凋亡率MA

9、CS組均低于Control組和DGC組，DGC組均低于Control組，均存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，且P＜0.05。
　　5.Control組，DGC組和MACS組中少弱精癥患者caspase-3檢測(cè)的凋亡率PAS分別是17.92％±4.04％，11.648％±2.87％，5.74％±1.69％，TUNEL分析凋亡率19.80％±5.07％，10.73％±3.59％，6.36％±2.63％。兩種方法檢測(cè)的凋亡率MACS組的凋亡率均低于Con