乙醇發(fā)酵相關(guān)基因在芽孢桿菌中的表達(dá)及分析.pdf

1、20世紀(jì)70年代的石油危機(jī)及當(dāng)今世界對(duì)能源需求的急劇增長(zhǎng)，加快了人們開發(fā)燃油替代能源的步伐。作為傳統(tǒng)的生物發(fā)酵產(chǎn)品和潛力巨大的燃料，乙醇已被公認(rèn)為是最有發(fā)展前景的可再生清潔能源之一。木質(zhì)纖維素是世界上最豐富的可再生資源。對(duì)木質(zhì)纖維素利用的研究，特別是通過(guò)微生物將木質(zhì)纖維素轉(zhuǎn)化為乙醇是當(dāng)前的研究熱點(diǎn)之一，也是難點(diǎn)之一。
　　本文以運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌作為出發(fā)菌株，以質(zhì)粒 pMA5作為表達(dá)載體，通過(guò) PCR擴(kuò)增得到乙醇發(fā)酵關(guān)鍵酶乙醇脫氫酶基

2、因 adh，進(jìn)而構(gòu)建重組質(zhì)粒pMA5-adh并轉(zhuǎn)化枯草芽孢桿菌，構(gòu)建表達(dá)乙醇脫氫酶基因的芽孢桿菌工程菌株。通過(guò)測(cè)定乙醇脫氫酶酶活及其影響因素研究乙醇脫氫酶基因adh在芽孢桿菌中的表達(dá)及酶學(xué)特性。
　　克隆得到的運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌adh開放閱讀框全長(zhǎng)1152 bp，編碼383個(gè)氨基酸，推測(cè)的蛋白質(zhì)分子量為40.16 kDa，蛋白的理論等電點(diǎn)為5.61。利用化學(xué)感受態(tài)法成功的將乙醇脫氫酶基因adh轉(zhuǎn)入枯草芽孢桿菌中，得到的轉(zhuǎn)化子能夠穩(wěn)定遺

3、傳。
　　通過(guò)對(duì)轉(zhuǎn)化子乙醇脫氫酶的酶學(xué)特性研究發(fā)現(xiàn)，枯草芽孢桿菌轉(zhuǎn)化子的產(chǎn)酶高峰出現(xiàn)在18h，重組乙醇脫氫酶酶促反應(yīng)的最適pH為10.0，最適溫度為47℃，K＋對(duì)ADH有促進(jìn)作用，酶活與標(biāo)準(zhǔn)狀態(tài)下比較提高了8.8％；二價(jià)金屬離子對(duì)ADH有不同程度的抑制作用，Cu2＋的抑制作用較強(qiáng)，酶活被抑制了76.8%，Zn2＋和Co2＋也有一定程度的抑制作用，均被抑制了27.5%，Mg2＋對(duì)ADH幾乎沒有影響。
　　本文通過(guò)對(duì)運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞