HCV蛋白NS5A在胰島素信號通路中的作用.pdf

1、研究背景
　　 丙型肝炎病毒(HepatitisCvirus，HCV)是一種主要經(jīng)過血液傳播的嗜肝性病毒，其慢性感染可引起慢性丙型肝炎，進(jìn)而可導(dǎo)致肝硬化或肝細(xì)胞癌。據(jù)WHO統(tǒng)計(jì)，全球丙型肝炎病毒(HCV)感染者約1.7億（感染率約為3％），我國HCV感染率為3.2％，且感染率仍有逐年上升的趨勢。然而HCV感染治療的手段有限，主要依靠α-干擾素，及以α-干擾素為主體再附加其他輔助手段。目前也還沒有有效疫苗，使得HCV感染成為一個(gè)重

2、要的社會(huì)問題。盡管科學(xué)研究受到廣泛的重視，但HCV感染的分子機(jī)制還有許多不清楚，從而影響了臨床丙肝病毒感染的治療手段的發(fā)展。
　　 HCV屬黃病毒科丙型肝炎病毒屬。HCV編碼多個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白和非結(jié)構(gòu)蛋白，其中NS5A是一個(gè)重要的非結(jié)構(gòu)蛋白。它有兩種磷酸化形式:p56和p58，它們均可以與宿主內(nèi)多種信號蛋白發(fā)生作用。近來的研究發(fā)現(xiàn)NS5A與胰島素信號通路（Insulin/PI3K/Akt通路）之間存在關(guān)聯(lián)。而胰島素信號通路在細(xì)胞代謝、

3、細(xì)胞周期調(diào)控、細(xì)胞生長凋亡等多種生物學(xué)過程中發(fā)揮著重要的作用。這意味著NS5A可能通過改變胰島素信號通路，從而在HCV感染過程中發(fā)揮其作用。在正常情況下這條信號通路受到嚴(yán)格的調(diào)控，其穩(wěn)態(tài)的變化與不同疾病的發(fā)生相聯(lián)系。當(dāng)Insulin/PI3K/Akt信號通路中的關(guān)鍵分子PI3K（調(diào)節(jié)亞基p85和催化亞基p110）、Akt等編碼基因的功能發(fā)生改變，可導(dǎo)致細(xì)胞代謝障礙[2-3]、細(xì)胞周期及細(xì)胞生長凋亡紊亂而引起各種疾病，例如腫瘤。HCV蛋白

4、NS5A可結(jié)合并激活PI3K，導(dǎo)致下游分子絲氨酸/蘇氨酸激酶，即Akt/蛋白激酶B的激活，破壞了信號通路在體內(nèi)的穩(wěn)態(tài)，導(dǎo)致HCV感染的細(xì)胞持續(xù)增殖而引發(fā)一系列病理效應(yīng)，包括抗病毒抗性的產(chǎn)生[4-5]、肝細(xì)胞癌發(fā)生等[6-7]。
　　 PTEN是除p53之后一個(gè)重要的抑癌基因。該基因功能的降低與多種組織的腫瘤發(fā)生有關(guān)。曾有研究報(bào)道丙肝導(dǎo)致的肝癌中，PTEN的功能降低。而PTEN是胰島素信號的主要負(fù)調(diào)節(jié)因子，抑制Insulin/PI

5、3K/Akt信號，從而與HCV激活I(lǐng)nsulin/PI3K/Akt信號作用相對抗。本論文研究了抑癌基因PTEN與細(xì)胞胰島素信號通路穩(wěn)態(tài)的關(guān)系，及HCV蛋白NS5A對細(xì)胞胰島素信號通路穩(wěn)態(tài)的破壞作用，顯示了PTEN與NS5A從正反兩個(gè)方面影響胰島素信號通路，通過改變該信號通路的穩(wěn)態(tài)，從而影響細(xì)胞的命運(yùn)。
　　 第一部分PTEN對Insulin/PI3K/Akt信號通路穩(wěn)態(tài)的作用
　　 [目的]
　　 既然，丙肝肝癌

6、中，PTEN的功能減弱。因此，我們首先研究PTEN與Insulin/PI3K/Akt穩(wěn)態(tài)的關(guān)系。我們以人肝癌細(xì)胞系HepG2為研究模型，用胰島素刺激、或上調(diào)或沉默PTEN的表達(dá)等，利用Westernblot技術(shù)，從蛋白水平層面研究Insulin/PI3K/Akt信號通路的穩(wěn)態(tài)變化。
　　 [方法]
　　 1、常規(guī)培養(yǎng)HepG2細(xì)胞傳代均勻鋪十二孔板，待長至約90％后，予血清饑餓24小時(shí)后裂解細(xì)胞。裂解細(xì)胞前予insuli

7、n刺激10min（胰島素工作濃度為2ul/ml，用無血清DMEM液稀釋）或加入同體積的無血清DMEM培養(yǎng)液作對照，分為insulin刺激組或control組，裂解細(xì)胞提取總蛋白，Westernblot蛋白分析法檢測p-Akt蛋白表達(dá)水平。
　　 2、常規(guī)培養(yǎng)的HepG2細(xì)胞根據(jù)轉(zhuǎn)染攜帶人野生型PTEN的真核表達(dá)質(zhì)粒(pSvEGFP-PTEN)或磷酸酶域突變型質(zhì)粒pSvEGFP-C124S兩種不同質(zhì)粒分為兩組，即PTENwt組及P

8、TENC124S組，轉(zhuǎn)染、血清饑餓同上。兩組均予等量等濃度胰島素刺激10min后裂解細(xì)胞，提取總蛋白。Westernblot蛋白分析檢測p-Akt蛋白表達(dá)水平。
　　 3、常規(guī)培養(yǎng)的HepG2細(xì)胞根據(jù)轉(zhuǎn)染PTENsiRNA及其controlsiRNA分為兩組，即PTENsiRNA組及control組，轉(zhuǎn)染、血清饑餓及胰島素刺激同上。轉(zhuǎn)染共48小時(shí)后常規(guī)裂解細(xì)胞，提取總蛋白。Westernblot蛋白分析法檢測PTEN及p-Akt

9、兩種蛋白表達(dá)水平。
　　 4、所有結(jié)果經(jīng)Excel2010及SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件分析，數(shù)據(jù)以“算術(shù)平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤（M±S.E.M）”表示。兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)(Independent-SamplesTTest)或兩個(gè)獨(dú)立樣本比較的Wilcoxon秩和檢驗(yàn)，以P值＜0.05視為有顯著性差異。
　　 [結(jié)果]
　　 1、Westernblot檢測結(jié)果顯示insulin刺激組較control組p-Akt蛋白

10、表達(dá)水平顯著提高(P＜0.010)，Westernblot以β-actin作內(nèi)參，兩組灰度比值比分別為0.221±0.136及0.000±0.000。
　　 2、Westernblot檢測結(jié)果顯示PTENC124S組較PTENwt組Akt磷酸化水平有所提高(灰度比值比分別為0.360±0.141和0.084±0.055，P＜0.05)。
　　 3、Westernblot檢測結(jié)果顯示PTENsiRNA組比control組H

11、epG2細(xì)胞PTEN蛋白表達(dá)水平偏低(P＜0.05)，相應(yīng)的p-Akt蛋白表達(dá)水平卻相對顯著提高(P＜0.005)。
　　 [結(jié)論]
　　 1、胰島素可以誘導(dǎo)Insulin/PI3K/Akt信號通路的激活。
　　 2、當(dāng)Insulin/PI3K/Akt信號通路中某一環(huán)節(jié)如負(fù)調(diào)控因子PTEN基因點(diǎn)突變或敲低，可引起下游信號分子Akt活化。
　　 3、在正常情況下Insulin/PI3K/Akt信號通路受到嚴(yán)

12、格的調(diào)控，外源性干預(yù)使信號通路中任一環(huán)節(jié)受阻或失控，這一穩(wěn)態(tài)將被打破，或過度抑制或過度激活。
　　 第二部分HCV蛋白NS5A在Insulin/PI3K/Akt信號通路中的作用
　　 [目的]
　　 上一部分顯示，PTEN對Insulin/PI3K/Akt穩(wěn)態(tài)的作用。接著，我們研究NS5A對Insulin/PI3K/Akt的影響。我們將丙肝病毒NS5A質(zhì)粒導(dǎo)入Insulin/PI3K/Akt信號通路活躍的人肝癌細(xì)

13、胞系HepG2細(xì)胞中，從蛋白水平探求丙肝病毒(HCV)蛋白NS5A對于PI3K/Akt通路的調(diào)控作用及其初步機(jī)制，為臨床上丙肝慢性遷延、肝細(xì)胞癌發(fā)生及抗病毒抗性等方面提供依據(jù)。
　　 [方法]
　　 1、HepG2細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染NS5A質(zhì)?；?qū)φ湛蛰d體，轉(zhuǎn)染相應(yīng)質(zhì)粒24小時(shí)后血清饑餓。轉(zhuǎn)染共48小時(shí)后胰島素刺激10min即常規(guī)裂解細(xì)胞提取總蛋白。以p-Akt抗體為一抗，Westernblot檢測Akt磷酸化水平。
　

14、　 2、常規(guī)培養(yǎng)的HepG2細(xì)胞根據(jù)轉(zhuǎn)染NS5A質(zhì)粒或?qū)φ湛蛰d體兩組不同質(zhì)粒分為NS5A組及control組，轉(zhuǎn)染48小時(shí)后常規(guī)裂解細(xì)胞提取總蛋白。采用免疫沉淀法檢測:將NS5A組或control組HepG2細(xì)胞總蛋白先與PI3K調(diào)節(jié)亞基p85多克隆抗體進(jìn)行免疫沉淀，再以anti-pTyr為Westernblot抗體檢測，比較兩組間p85酪氨酸磷酸化水平。
　　 3、常規(guī)培養(yǎng)HepG2細(xì)胞根據(jù)轉(zhuǎn)染NS5A質(zhì)?；?qū)φ湛蛰d體兩組不

15、同質(zhì)粒分為NS5A組及control組，轉(zhuǎn)染48小時(shí)后常規(guī)裂解細(xì)胞提取總蛋白。采免疫共沉淀法檢測:將NS5A組或control組HepG2細(xì)胞總蛋白先與PI3K催化亞基p85多克隆抗體進(jìn)行免疫沉淀，再以anti-p110為Westernblot抗體檢測，比較兩組間催化亞基p110與調(diào)節(jié)亞基p85的結(jié)合水平。
　　 4、所有結(jié)果經(jīng)Excel2010及SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件分析，數(shù)據(jù)以“算術(shù)平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤（M±S.E.M）”表示。

16、兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)(Independent-SamplesTTest)或兩個(gè)獨(dú)立樣本比較的Wilcoxon秩和檢驗(yàn)，以P值＜0.05視為有顯著性差異。
　　 [結(jié)果]
　　 1、Westernblot檢測結(jié)果顯示NS5A質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組HepG2細(xì)胞p-Akt蛋白水平較control組明顯上調(diào)(灰度比值比分別為0.811±0.131及0.205±0.066，P＜0.002)。
　　 2、免疫沉淀法檢測到NS5

17、A質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組的p85酪氨酸磷酸化水平較control組的高（灰度比值比分別為1.055±0.189及0.479±0.147，＜0.014）。
　　 3、免疫共沉淀法檢測結(jié)果顯示NS5A質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組與control組細(xì)胞的p85和p110蛋白結(jié)合無差異（灰度比值比分別為0.543±0.286及0.195，P＞0.05）。
　　 [結(jié)論]
　　 HCV蛋白NS5A可以與PI3K調(diào)節(jié)亞基p85蛋白相互作用，進(jìn)而激活I(lǐng)ns