院內(nèi)感染細(xì)菌16S rDNA基因分型高分辨熔解曲線方法的建立.pdf

1、目的：建立院內(nèi)感染常見9種細(xì)菌大腸埃希菌、銅綠假單胞菌、陰溝腸桿菌、鮑曼不動(dòng)桿菌、肺炎克雷伯菌、表皮葡萄球菌、金黃色葡萄球菌、糞腸球菌和屎腸球菌16S rDNA基因的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-高分辨率熔解曲線（PCR-HRM）的分子分型方法，并收集包含在上述9種菌內(nèi)的25株院內(nèi)感染細(xì)菌臨床分離株進(jìn)行PCR-HRM方法臨床驗(yàn)證。
　　方法：從文獻(xiàn)中檢索16S rDNA基因V1、V3、V6、V9高變區(qū)引物，收集9種院感細(xì)菌的標(biāo)準(zhǔn)株，使用上述引物

2、擴(kuò)增這9種菌對(duì)引物進(jìn)行驗(yàn)證；擴(kuò)增V3-V6區(qū)測(cè)序，測(cè)序結(jié)果上傳Genbank進(jìn)行同源性比對(duì)和分析，確定本實(shí)驗(yàn)所用的標(biāo)準(zhǔn)菌型別與Genbank中所報(bào)道的細(xì)菌種屬一致；對(duì)9種院感細(xì)菌標(biāo)準(zhǔn)株的16S rDNA基因V1、V3、V6、V9可變區(qū)進(jìn)行PCR-HRM，并根據(jù)以上各可變區(qū)的HRM熔解曲線形狀和Tm值差異建立亞組分析決定樹方法，分步對(duì)院內(nèi)感染常見的9種細(xì)菌鑒別；收集已確定為院內(nèi)感染細(xì)菌并包含在上述9種菌的臨床分離株25株，使用本實(shí)驗(yàn)建立的

3、亞組分析決定樹方法進(jìn)行盲法鑒定，鑒定結(jié)果與微生物表型鑒定結(jié)果進(jìn)行比較。
　　結(jié)果：（1）可使用V3、V6、V9區(qū)引物擴(kuò)增9種菌的目的產(chǎn)物，V1區(qū)引物只能用于擴(kuò)增4種革蘭陽性菌（表皮葡萄球菌、金黃色葡萄球菌、糞腸球菌和屎腸球菌）；本實(shí)驗(yàn)所用的菌株與Genbank中其相應(yīng)模式菌的相似性為99％-100%，可認(rèn)為所選用菌株的種屬無誤。（2）根據(jù)9種院感細(xì)菌標(biāo)準(zhǔn)株的16S rDNA基因V1、V3、V6、V9可變區(qū)的PCR-HRM結(jié)果，建立

4、了亞組分析決定樹方法：①在V1區(qū)鑒別革蘭氏陽性菌和陰性菌：4種革蘭氏陽性菌在V1區(qū)有目的產(chǎn)物，5種革蘭氏陰性菌無目的產(chǎn)物；②4種革蘭陽性菌鑒別：在V9區(qū)鑒別葡萄球菌（表皮葡萄球菌和金黃色葡萄球菌）和腸球菌（糞腸球菌和屎腸球菌）：葡萄球菌和腸球菌在V9區(qū)按Tm值不同分成兩群（葡萄球菌平均Tm=88.20℃；腸球菌平均Tm=89.75℃）；在V3區(qū)鑒別兩種葡萄球菌：兩種葡萄球菌在V3區(qū)熔解曲線形狀不同；在V1區(qū)鑒別兩種腸球菌：兩種腸球菌在V

5、1區(qū)內(nèi)Tm值相差較大（屎腸球菌Tm=85.74℃；糞腸球菌Tm=86.94℃）；③5種革蘭氏陰性菌鑒別：5種菌在V3區(qū)按照熔解曲線形狀和Tm值的差異分成3群，包括1群（肺炎克雷伯菌和鮑曼不動(dòng)桿菌），2群（陰溝腸桿菌和大腸埃希菌），3群（銅綠假單胞菌）；3群的熔解曲線為雙峰，且Tm值較高，可在V3區(qū)直接區(qū)分；在V6區(qū)鑒別1群細(xì)菌：兩種菌在V6區(qū)Tm值差異明顯（肺炎克雷伯菌Tm=86.20℃；鮑曼不動(dòng)桿菌Tm=84.84℃）；混熔鑒別2群細(xì)

6、菌：2群細(xì)菌在4個(gè)可變區(qū)的Tm值和曲線形狀差異均不明顯，因此設(shè)置大腸埃希菌為參考菌株，選擇V6區(qū)為擴(kuò)增區(qū)，與陰溝腸桿菌V6區(qū)擴(kuò)增產(chǎn)物混熔，結(jié)果顯示為雙峰。（3）25株臨床分離株的驗(yàn)證結(jié)果顯示，22株細(xì)菌的HRM鑒定結(jié)果與微生物表型鑒定結(jié)果一致，1株鑒定結(jié)果不一致（HRM鑒定為金黃色葡萄球菌，微生物表型鑒定結(jié)果為表皮葡萄球菌），2株無法使用亞組分析決定樹分組。
　　結(jié)論：利用PCR-HRM技術(shù)建立了院內(nèi)感染常見9種細(xì)菌鑒定的亞組分析