豬鏈球菌2型MRP的分子致病作用及16S～23S rDNA區(qū)間序列鑒定方法.pdf

1、豬鏈球菌2型（Streptococcus suis type2，SS2）是豬鏈球菌病的重要病原，能導致仔豬患腦膜炎、敗血癥、關節(jié)炎、心內膜炎、肺炎，且是一種重要的人畜共患病病原，對養(yǎng)豬業(yè)及公共衛(wèi)生均構成嚴重威脅.本文研究了重組豬鏈球菌2型MRP誘導豬肺巨噬細胞凋亡，以闡明豬鏈球菌2型的分子致病機理；建立了基于16S～23SrDNA區(qū)間序列（Intergenic Spacer region，ISR）的鑒定豬源鏈球菌的PCR方法；對豬鏈球菌

2、1998年江蘇分離株進行了病原學研究。
　　 以純化的重組豬鏈球菌2型MRP蛋白與豬肺巨噬細胞作用，研究MRP對豬巨噬細胞的致病作用，以探討MRP的致病機制.通過光學顯微鏡形態(tài)及電子顯微鏡形態(tài)觀察，DNA瓊脂凝膠電泳和流式細胞儀檢測等手段，研究MRP對豬巨噬細胞的作用.結果表明，50μg/mL和100μg/mL的重組MRP能誘導豬肺巨噬細胞發(fā)生凋亡，在作用6h后，光學顯微鏡和電子顯微鏡下可見感染細胞呈現(xiàn)典型的細胞凋亡形態(tài)，DNA

3、瓊脂凝膠電泳呈“梯帶”圖譜，流式細胞儀檢測結果顯示明顯的亞二倍體DNA峰，凋亡率分別為10.8％和13.32％。證實MRP是SS2的重要毒力因子.
　　 豬鏈球菌2型與馬鏈球菌獸疫亞種是我國豬源鏈球菌病的兩種主要病原，對養(yǎng)豬業(yè)構成嚴重威脅.本試驗利用16S-23SrDNA區(qū)間序列(ISR)的多態(tài)性，結合16SrDNA和23SrDNA的保守性，分別在16SrDNA末端和23SrDNA前端保守區(qū)設計上下游引物，PCR結果為23株豬源

4、和8株人源豬鏈球菌2型參考株及分離株擴增長度約為1180bp，1株豬鏈球菌2型弱毒株(T15)為1070bp，25株馬鏈球菌獸疫亞種約為1390bp，因此由PCR產(chǎn)物長度可區(qū)分豬鏈球菌和馬鏈球菌獸疫亞種，從而達到一對引物區(qū)分兩種細菌的目的。另外，針對豬鏈球菌2型和馬鏈球菌獸疫亞種，分別在16S-23S rDNA區(qū)間序列內設計兩對引物，結果顯示能特異性地擴增出230和190bp的目的片段。由此，基于16S-23SrDNA ISR的PCR技

5、術能鑒定豬鏈球菌2型和馬鏈球菌獸疫亞種。對三株代表菌(HA9801，T15，ATCC35246)的16S-23S rDNA ISR進行測序發(fā)現(xiàn)，種的差異表現(xiàn)為堿基的插入和缺失，此對引物為區(qū)分豬鏈球菌2型強毒和弱毒株提供了可能。
　　 取1998年在江蘇分離的3株豬源鏈球菌，進行了病原學鑒定。其形態(tài)、染色均符合鏈球菌的特點，具α或β溶血，生化試驗結果不穩(wěn)定。用國際通用的鏈球菌乳膠分型診斷液檢測上述分離株，均不在其檢測范圍，即不屬于