IGFBP-rP1在結直腸癌細胞上皮間質轉化中的作用及相關機制研究.pdf

1、結直腸癌是一類嚴重威脅人類健康和生存的惡性腫瘤，從世界范圍看，結直腸癌的發(fā)病率居男性惡性腫瘤的第三位，女性第二位。在我國，隨著居民生活方式和膳食結構的改變，以及人口老齡化進程的加快，結直腸癌的發(fā)病率上升趨勢明顯。盡管近年來結直腸癌的早期診斷及治療手段取得了一定的進步，但中晚期結直腸癌患者生存率并沒有得到實質性改善，而轉移和復發(fā)是導致患者死亡的主要原因。因此，積極開展對結直腸癌轉移機制的研究，尋找新的關鍵分子和治療靶點，對結直腸癌的干預和

2、治療具有重要的現(xiàn)實意義。
　　上皮間質轉化(Epithelial-Mesenchymal Transition，EMT)是一種基本的生理病理現(xiàn)象，最早在胚胎發(fā)育的相關研究領域中提出。一般認為EMT是指上皮細胞在特定的生理和病理情況下向間質細胞轉化的現(xiàn)象，在這個過程中，上皮細胞失去極性，細胞間連接消失，上皮標記物表達下調或缺失，而逐漸獲得間質細胞形態(tài)特征及相關標記物，并且細胞的遷移侵襲能力增強，EMT也可使細胞獲得一些干細胞的生物學

3、特性，抵抗凋亡和衰老。同時，在一定的條件下，具有間質表型的腫瘤細胞又可轉化為具有上皮表型特征的腫瘤細胞，即間質上皮轉化(Mesenchymal-Epithelial Transition，MET)。從結直腸癌經典形態(tài)學觀察發(fā)現(xiàn)，在腫瘤浸潤轉移過程中存在形態(tài)學的可逆性變化，免疫組織化學標記和分子生物學研究證明，結直腸癌細胞存在EMT和MET的過程。在20-40％的結直腸癌組織中所觀察到的腫瘤芽被認為是EMT在結直腸癌組織形態(tài)上的表現(xiàn)。目前

4、普遍認為EMT在結直腸癌的轉移中發(fā)揮著重要的作用。有關EMT發(fā)生的分子機制及其復雜，細胞內外的多種分子和信號通路參與其中。一些生長因子如TGF-β、FGF、EGF、IGF、HGF、PDGF等通過自分泌或旁分泌的方式，激活胞內不同的信號通路，各種信號通路相互交錯形成復雜的網(wǎng)絡調控著EMT的發(fā)生。其中，TGF-β信號通路研究的最為充分詳盡。TGF-β是目前最為常用的EMT誘導因子，在體外實驗中，大多數(shù)學者采用TGF-β作為誘導腫瘤細胞發(fā)生E

5、MT的重要手段。
　　胰島素樣生長因子結合蛋白-相關蛋白1(insulin-like growth factor bindingprotein-related protein1，IGFBP-rP1)也稱為IGFBP7，與傳統(tǒng)的IGFBP1-6不同，其與IGF結合能力較低，而與胰島素的結合能力較強，因此，IGFBP-rP1可能具有不同于傳統(tǒng)IGFBP家族成員的新的生物學功能。IGFBP-rP1在不同實驗室通過不同的差減文庫被篩選到，

6、由于其來源及功能的不同，具有多個不同的命名。我們實驗室自從應用抑制性差減雜交法篩選出IGFBP-rP1后，一直致力于其生物學效應和分子機制的研究。我們發(fā)現(xiàn)，IGFBP-rP1的過表達可抑制結直腸癌細胞的生長，降低其軟瓊脂克隆形成能力，誘導細胞凋亡和衰老，在結直腸癌中發(fā)揮著潛在的抑癌作用，這在肺癌、乳腺癌、前列腺癌、肝癌等腫瘤細胞中也得到了驗證。最近一些體內外的研究發(fā)現(xiàn)，IGFBP-rP1可影響細胞的遷移侵襲能力，我們前期實驗也發(fā)現(xiàn)在結直

7、腸癌細胞中采用去甲基化藥物5-aza-dC處理恢復IGFBP-rP1的表達后，細胞的遷移侵襲能力減弱。因此，本課題的目的是明確IGFBP-rP1在結直腸癌細胞EMT中的作用，并探討相關的分子機制。
　　我們在不同的無內源性表達IGFBP-rP1的結直腸癌細胞SW620、CW2及HT29中分別建立了穩(wěn)定表達IGFBP-rP1的單克隆細胞株，通過Western blot、 Real-timeRT-PCR、細胞免疫熒光、細胞劃痕以及Tr

8、answell小室等方法，分析IGFBP-rP1對結直腸癌細胞EMT的影響。我們發(fā)現(xiàn)，在結直腸癌細胞中過表達IGFBP-rP1后可上調上皮標記物E-cadherin的表達，其主要分布在細胞膜及細胞漿;而間質標記物N-cadherin，vimentin，MMP9的表達均有不同程度的下調，EMT相關轉錄因子ZEB1和Snail的表達也顯著降低。細胞劃痕和Transwell小室遷移實驗顯示IGFBP-rP1過表達可顯著抑制結直腸癌細胞的遷移能

9、力。在無內源性表達IGFBP-rP1的結直腸癌細胞中外源性加入IGFBP-rP1重組蛋白(rhIGFBP-rP1)也可以觀察到與轉染相似的結果，rhIGFBP-rP1可細微上調上皮標記物的表達，而下調間質標記物的表達。由此可見，在結直腸癌細胞中過表達IGFBP-rP1可抑制EMT過程，也進一步說明IGFBP-rP1可通過自分泌或旁分泌途徑而發(fā)揮作用。
　　我們進一步選取IGFBP-rP1表達陽性的結直腸癌細胞SW480，采用shR

10、NA干擾的方法沉默IGFBP-rP1的表達，進一步分析IGFBP-rP1與EMT的關系。我們從上海吉瑪制藥技術有限公司訂購了pGPU6/GFP/Neo shRNA Expression Vector Kit，采用Lipofectamine2000試劑進行轉染，通過RT-PCR和Western blot的方法對干擾效果進行驗證，并篩選到穩(wěn)定干擾IGFBP-rP1的單克隆細胞株，我們選取兩個單克隆進行后續(xù)的實驗。Western blot結果

11、顯示，在SW480細胞中沉默IGFBP-rP1的表達后可顯著下調上皮標記物ZO-1的表達，上調間質標記物N-cadherin，vimentin及MMP9的表達。另外，EMT相關轉錄因子ZEB1和Snail的表達在IGFBP-rP1沉默之后也有不同程度的增加。細胞劃痕和Transwell小室實驗也證明，在SW480細胞中沉默IGFBP-rP1表達后可顯著增強細胞的遷移侵襲能力。以上結果說明，在結直腸癌細胞中沉默IGFBP-rP1表達可促進

12、EMT的發(fā)生。另外，我們在穩(wěn)定干擾IGFBP-rP1的單克隆細胞株中瞬時轉染表達載體PcDNA3.1(IGFBP-rP1)或外源性加入rhIGFBP-rP1，觀察恢復IGFBP-rP1表達是否可以逆轉其沉默所誘導的EMT過程。我們發(fā)現(xiàn)恢復IGFBP-rP1表達后可逆轉IGFBP-rP1沉默所引起的EMT標記物的表達變化及細胞遷移能力的增加，進一步證明IGFBP-rP1可阻止EMT的發(fā)生。
　　復雜的EMT過程也會涉及細胞骨架的變化

13、，我們采用熒光素標記的鬼筆環(huán)肽對細胞染色，在激光掃描共聚焦顯微鏡下直接觀察IGFBP-rP1過表達對結直腸癌細胞骨架(F-actin)的影響。結果顯示，在原始SW620細胞中，F(xiàn)-actin排列紊亂，無規(guī)則，在細胞周邊有明顯的板狀及絲狀偽足伸出;空載體對照細胞中也觀察到類似現(xiàn)象，而在穩(wěn)定轉染過表達IGFBP-rP1的細胞中，F(xiàn)-actin排列規(guī)則，細胞周圍無明顯偽足形成，這與轉染細胞株較弱的遷移能力是相一致的。
　　TGF-β1是

14、最常用的EMT誘導因子，我們以10ng/ml TGF-β1刺激HT29細胞之后，TGF-β/Smad信號通路激活，Smad2/3的磷酸化水平明顯增加，HT29細胞在TGF-β1處理之后也出現(xiàn)EMT特征，間質標記物表達上調，細胞遷移能力增加。而外源性加入rhIGFBP-rP1則可逆轉TGF-β1所誘導的EMT現(xiàn)象，進一步說明IGFBP-rP1在結直腸癌細胞發(fā)生EMT的過程中發(fā)揮著抑制作用。同時，rhIGFBP-rP1可抑制TGF-β/Sm

15、ad信號通路的活性，p-Smad2/3水平明顯降低。在結直腸癌細胞中過表達IGFBP-rP1可下調Smad2的磷酸化水平，而沉默IGFBP-rP1后則可上調Smad2的磷酸化水平，這均提示IGFBP-rP1可能通過影響TGF-β/Smad信號通路發(fā)揮作用。
　　我們也初步分析了IGFBP-rP1對Wnt干言號通路的影響。首先檢測了Wnt信號通路中的關鍵因子β-catenin，發(fā)現(xiàn)在結直腸癌細胞中過表達或沉默IGFBP-rP1并不影

16、響β-catenin在mRNA及蛋白水平上的表達變化，且Wnt信號通路下游靶基因c-myc、cyclinD1及survivin也未見明顯改變，可見IGFBP-rP1對Wnt信號通路并無顯著影響。然而采用激光掃描共聚焦顯微鏡觀察β-catenin在細胞中定位情況發(fā)現(xiàn)，過表達IGFBP-rP1后可明顯減少β-catenin在細胞核中的分布，提取胞核蛋白，采用Westernblot檢測也發(fā)現(xiàn)過表達IGFBP-rP1可減少β-catenin在胞

17、核中的表達。雖然IGFBP-rP1對β-catenin的表達水平沒有顯著影響，但其可能通過某些機制影響β-catenin在細胞中的分布，利于其粘附功能的發(fā)揮而維持上皮細胞表型。
　　綜合上述研究結果，我們得出以下結論:
　　1.在結直腸癌細胞中，IGFBP-rP1誘導上皮標記物的表達，下調間質標記物的表達，同時降低細胞的遷移侵襲能力，在EMT過程中發(fā)揮抑制作用。
　　2.在結直腸癌細胞中，IGFBP-rP1可能通過影響