TFF1和TFF3在結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移中的作用及與上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的關(guān)系研究.pdf

1、結(jié)直腸癌是消化道系統(tǒng)常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，我國(guó)大腸癌發(fā)病率位于惡性腫瘤的第三位，死亡率位于惡性腫瘤死亡率的第五位，在歐美等西方國(guó)家占惡性腫瘤死因的第二位。近幾十年來(lái)，隨著人民生活水平的提高及飲食結(jié)構(gòu)的變化，大腸癌的發(fā)病率、死亡率逐年增高，且有年輕化趨勢(shì)。根治性治療后異時(shí)性轉(zhuǎn)移，特別是肝轉(zhuǎn)移是預(yù)后不良的主要原因。約35％結(jié)直腸癌確診即伴有肝轉(zhuǎn)移，同時(shí)性肝轉(zhuǎn)移率為15-25%，異時(shí)性肝轉(zhuǎn)移率40-50%。尸檢甚至高達(dá)60％～70％。篩選高?；?/p>

2、者及有效的腫瘤標(biāo)記物是改善預(yù)后的重要環(huán)節(jié)。
　　三葉因子（trefoil factor TFF）家族具有一個(gè)或多個(gè)三葉因子結(jié)構(gòu)域的多肽小分子，主要由消化道黏液分泌上皮細(xì)胞合成和分泌，在粘膜損傷修復(fù)過(guò)程中起主要作用。TFF家族有三個(gè)成員：TFF1（乳腺癌相關(guān)肽，pS2）、TFF2（解痙多肽，SP）和TFF3（腸三葉因子，ITF）。TFF在整個(gè)消化系統(tǒng)中均有表達(dá)分布，胃腸道是TFF的主要合成場(chǎng)所。TFF1和TFF2在胃部，TFF3則主

3、要在大腸和小腸呈高表達(dá)。近年來(lái)TFF家族與腫瘤發(fā)生，侵襲及臨床預(yù)后等方面的相關(guān)性廣受關(guān)注。近來(lái)研究表明TFF1在乳腺癌、胰腺癌、肺癌、膀胱癌等許多腫瘤和轉(zhuǎn)移灶中表達(dá)，與腫瘤細(xì)胞增殖、凋亡、轉(zhuǎn)移和腫瘤血管生成有關(guān)，因而被認(rèn)為是一種癌基因。研究者還認(rèn)為T(mén) FF3有抑制細(xì)胞粘附，促進(jìn)癌細(xì)胞侵襲，阻斷細(xì)胞凋亡的作用,其高表達(dá)提示胃癌預(yù)后差。TFF1和TFF3作為檢測(cè)乳腺癌細(xì)胞播散的標(biāo)志物。TFF1和TFF3表達(dá)與乳腺癌、胃癌等發(fā)病，進(jìn)展和預(yù)后之

4、間的關(guān)系研究較多。但它們與結(jié)直腸癌發(fā)生、發(fā)展及臨床預(yù)后等之間相關(guān)性的報(bào)道寥寥無(wú)幾。
　　Twist1基因是一種在胚胎發(fā)育過(guò)程中起關(guān)鍵調(diào)控作用的轉(zhuǎn)錄因子，是一種高度保守的堿性螺旋-環(huán)-螺旋（basichelix-loop-helix，bHLH）蛋白家族的重要成員。近期研究證實(shí)，Twist基因廣泛地參與了調(diào)控器官的生長(zhǎng)發(fā)育、腫瘤發(fā)生、細(xì)胞增殖分化等過(guò)程。Twist基因也具有癌基因的特性，能夠編碼凋亡抑制蛋白，影響腫瘤細(xì)胞的凋亡，抑制細(xì)

5、胞分化、誘導(dǎo)上皮-間質(zhì)變（epithelial-mesenchymal transition,EMT）的發(fā)生、參與腫瘤的耐藥以及腫瘤血管的生成過(guò)程從而在腫瘤發(fā)生及侵襲轉(zhuǎn)移過(guò)程中發(fā)揮重要的作用。研究顯示TFF3的抗炎癥特性可能通過(guò)對(duì)Twist的調(diào)節(jié)，因?yàn)門(mén)FF3可以持續(xù)上調(diào)Twist蛋白表達(dá)。
　　所以我們圍繞：
　?。?）TFF1，TFF3和Twist1能否在結(jié)直腸癌侵襲轉(zhuǎn)移中起作用，是否與臨床病理因素及預(yù)后相關(guān)。
　

6、?。?）TFF1和TFF3促癌的作用是否與上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化有關(guān)等兩個(gè)問(wèn)題展開(kāi)我們的研究。
　　第一部分：TFF1、TFF3和Twist1蛋白在不同轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)
　　目的：檢測(cè)TFF1、TFF3和Twist1在不同轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)情況，了解其差異表達(dá)及其與結(jié)直腸癌臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系。
　　方法：采用免疫組織化學(xué)方法（SP法）檢測(cè)TFF1、TFF3和Twist1蛋白在75例結(jié)直腸癌、47例癌旁正

7、常組織、30例轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)及10例肝轉(zhuǎn)移灶中的表達(dá)。收集符合條件的臨床病例的臨床資料，進(jìn)行分析。
　　結(jié)果：TFF1和TFF3主要表達(dá)在細(xì)胞漿，胞膜亦有部分表達(dá)，而Twist1在胞漿和胞核均有表達(dá)。TFF1、TFF3和Twist在結(jié)直腸癌中表達(dá)率分別為66.7%(50/75)，78.7%(59/75)和54.7%(41/75)，而在癌旁正常組織中表達(dá)率為27.3%(13/47)，100%(47/47)和17%(8/47)。與原發(fā)灶相

8、比，TFF3和Twist1在轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)和肝轉(zhuǎn)移灶中的表達(dá)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.879，P=0.105 for TFF3 andP=0.08，P=0.780 for Twist1)，而TFF1在轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)和原發(fā)灶之間表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。雖無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，TFF1及TFF3隨轉(zhuǎn)移而表達(dá)有增強(qiáng)趨勢(shì)。TFF3和Twist1高表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、病理分期和不良預(yù)后相關(guān)（P＜0.05）。TFF1高表達(dá)只與分化程度相關(guān)（P＜0.05），

9、而與預(yù)后無(wú)相關(guān)性（P＞0.05）。TFF1和TFF3表達(dá)水平之間關(guān)系有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，并兩者呈負(fù)相關(guān)關(guān)系（P=0.014 r=-0.291）。
　　結(jié)論：TFF1、TFF3和Twist1在結(jié)直腸癌組織和癌旁組織中表達(dá)有明顯差異，原發(fā)灶和不同轉(zhuǎn)移灶之間亦有表達(dá)差異，但此差異達(dá)不到統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。TFF3和Twist1高表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、病理分期和不良預(yù)后相關(guān)，可作為判斷預(yù)后指標(biāo)。
　　第二部分：TFF1、TFF3和Twist1基因在不

10、同轉(zhuǎn)移潛能結(jié)腸癌細(xì)胞系中表達(dá)的研究
　　目的：檢測(cè)TFF1、TFF3和Twist1 mRNA和蛋白在不同轉(zhuǎn)移潛能結(jié)腸癌細(xì)胞系中表達(dá)情況，以了解三種基因表達(dá)與腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的關(guān)系。
　　方法：RT-PCR和Western-blot檢測(cè)TFF1、TFF3和Twist1 mRNA和蛋白在轉(zhuǎn)移能力不同的人結(jié)腸癌細(xì)胞系（HT-29，SW620，LOVO）中的表達(dá)情況，以了解有無(wú)差異表達(dá)。用HIEC（永生化人類(lèi)腸粘膜上皮細(xì)胞系）作對(duì)照。<

11、br>　　結(jié)果：
　　1. TFF1、TFF3和Twist1 mRNA在不同轉(zhuǎn)移潛能結(jié)腸癌細(xì)胞系中表達(dá)QRT-PCR結(jié)果顯示：HIEC、HT29、SW620、LOVO四種細(xì)胞株中的TFF1 mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為0.595±0.257、3.257±1.424、2.275±0.372和0。除LOVO細(xì)胞系外，其余結(jié)腸癌細(xì)胞系中TFF1表達(dá)均較正常腸上皮細(xì)胞高（P＜0.05），且隨細(xì)胞株轉(zhuǎn)移潛能的逐漸增強(qiáng)，TFF1表達(dá)量逐漸降低（P

12、＜0.05）。TFF3 mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為0、0.0329±0.0181、1.339±0.2168和0?？梢?jiàn)TFF3 mRNA正常腸上皮細(xì)胞系中不表達(dá)，而結(jié)腸癌細(xì)胞系中表達(dá)增高（除LOVO細(xì)胞系），且高轉(zhuǎn)移細(xì)胞系SW620中表達(dá)量較低轉(zhuǎn)移潛能細(xì)胞系HT29明顯高（P＜0.05）。Twist1 mRNA相對(duì)表達(dá)量分別0.233±0.093、0.485±0.0535、1.547±0.379和3.410±0.493?？梢?jiàn)正常腸上皮細(xì)胞系

13、中表達(dá)低，而結(jié)腸癌細(xì)胞系中表達(dá)量均增高（P＜0.05），且隨結(jié)腸癌細(xì)胞系轉(zhuǎn)移潛能的增強(qiáng)，Twist1 mRNA表達(dá)量逐漸升高（P＜0.05）。在高轉(zhuǎn)移LOVO細(xì)胞中的Twist1 mRNA表達(dá)量顯著高于其它兩株，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。在轉(zhuǎn)移能力較低的SW620細(xì)胞及HT29細(xì)胞中的表達(dá)均較低，兩組間差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。
　　2．TFF1、TFF3和Twist1蛋白在轉(zhuǎn)移能力不同的結(jié)腸癌細(xì)胞系中表達(dá)We

14、stern-blot結(jié)果顯示：HIEC、HT29、SW620、LOVO四種細(xì)胞株中的TFF1蛋白的表達(dá)量分別為1371±114.7、26074±1413、8076±1171和343.61±91.47。除LOVO細(xì)胞系外，TFF1蛋白在結(jié)腸癌細(xì)胞系中表達(dá)量較正常腸上皮細(xì)胞系高（P＜0.05），結(jié)腸癌細(xì)胞系中表達(dá)量隨著轉(zhuǎn)移潛能的增強(qiáng)而逐漸降低（P＜0.05）。TFF3蛋白的表達(dá)量分別為48.22±10.60、365.6±83.51、929.

15、20±92.95和45.69±7.11。TFF3蛋白在正常腸上皮中不表達(dá)，而結(jié)腸癌細(xì)胞系中表達(dá)量升高（除LOVO細(xì)胞系外）。隨著結(jié)腸癌細(xì)胞系轉(zhuǎn)移潛能的增強(qiáng)，表達(dá)量亦逐漸增高（P＜0.05）（除LOVO細(xì)胞系外）。Twist1蛋白的表達(dá)量分別為1706±198.4、3859±166.9、3524±192.2和7831±222.2。Twist1蛋白在結(jié)腸癌細(xì)胞系中表達(dá)量較正常腸上皮細(xì)胞系高（P＜0.05）。隨著轉(zhuǎn)移潛能的增強(qiáng)，Twist1表

16、達(dá)量逐漸增高，高轉(zhuǎn)移細(xì)胞系LOVO中表達(dá)量最高。
　　結(jié)論：隨著結(jié)腸癌細(xì)胞系轉(zhuǎn)移潛能的升高，TFF1表達(dá)量逐漸下降，而TFF3和Twist1表達(dá)量呈逐漸上升趨勢(shì)，表明TFF3和Twist1起促進(jìn)轉(zhuǎn)移，而TFF1在結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移中可能起保護(hù)作用。
　　第三部分：TFF1、TFF3基因表達(dá)與上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的關(guān)系
　　目的：觀(guān)察 TFF1和TFF3以及上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)目標(biāo)基因（Twist1，snail，E-cadherin，vim

17、entin，β-catenin）在不同轉(zhuǎn)移潛能結(jié)腸癌細(xì)胞系中的表達(dá)趨勢(shì)，初步判斷 TFF1和TFF3是否與上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)。
　　方法：應(yīng)用實(shí)時(shí)定量 RT-PCR和Western-blot檢測(cè) HIEC、HT29、SW620、LOVO等不同轉(zhuǎn)移潛能結(jié)腸癌細(xì)胞系中Twist1、snail、E-cadherin、vimentin、β-catenin等上皮間質(zhì)化相關(guān)基因mRNA和蛋白表達(dá)情況，與TFF1和TFF3表達(dá)趨勢(shì)對(duì)比，判斷相互關(guān)

18、系。
　　結(jié)果：HIEC、HT29、SW620、LOVO四種細(xì)胞株中的E-cadherin mRNA表達(dá)量分別為0、7.247±2.687、0.888±0.271和0，而蛋白表達(dá)量為322.2±76.8、2281±135.6、641.1±57.4和285.6±43.46。HT29和SW620結(jié)腸癌細(xì)胞系中E-cadherin mRNA和蛋白相對(duì)表達(dá)量均較正常腸上皮細(xì)胞高（P＜0.05），且隨細(xì)胞系轉(zhuǎn)移潛能的逐漸增強(qiáng)，E-cadhe

19、rin mRNA和蛋白表達(dá)量逐漸降低（P＜0.05）。Vimentin mRNA表達(dá)量分別為0.752±0.121、1.334±0.317、1.940±0.213和0.005，而蛋白表達(dá)量分別為492.8±67.5、953.1±74.8、1622±108.4和141.2±33.4?？梢?jiàn)Vimentin mRNA和蛋白在HT29和SW620結(jié)腸癌細(xì)胞系中表達(dá)較正常腸上皮細(xì)胞系高，而LOVO細(xì)胞系中不表達(dá)。高轉(zhuǎn)移細(xì)胞系SW620中表達(dá)量較低

20、轉(zhuǎn)移潛能細(xì)胞系HT29無(wú)顯著性差異，但較正常腸上皮細(xì)胞系明顯高（P＜0.05）。β-catenin mRNA表達(dá)量分別0.368±0.132、3.560±1.806、1.868±0.222和0.619±0.588，而蛋白表達(dá)量8814±1363、20962±1584、12372±1160、5096±748.5?？梢?jiàn)正常腸上皮細(xì)胞系中表達(dá)低，而結(jié)腸癌細(xì)胞系中表達(dá)量均升高，且隨結(jié)腸癌細(xì)胞系轉(zhuǎn)移潛能的增強(qiáng)，β-catenin mRNA和蛋白表

21、達(dá)量逐漸下降（P＜0.05）。Snail mRNA表達(dá)量分別0.255±0.013、1.650±0.225、1.910±0.253和0.033±0.025，而蛋白表達(dá)量448±104.5、544±107.2、1341±84.3和130.2±26.2。可見(jiàn)正常腸上皮細(xì)胞系中表達(dá)低，而HT29和SW620結(jié)腸癌細(xì)胞系中表達(dá)量均升高，且隨結(jié)腸癌細(xì)胞系轉(zhuǎn)移潛能的增強(qiáng)，Snail mRNA和蛋白表達(dá)量逐漸上升趨勢(shì)（P＜0.05）。隨著三個(gè)結(jié)腸癌細(xì)

22、胞系轉(zhuǎn)移潛能的增強(qiáng)，E-cadherin、β-catenin（上皮細(xì)胞標(biāo)志物）的表達(dá)量逐漸下降。vimentin、snail和Twist1等（間充質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物）表達(dá)量逐漸增高。
　　結(jié)論：TFF1和TFF3在上皮間質(zhì)化過(guò)程中起一定作用，而在此過(guò)程中TFF1和TFF3可能起相反作用。
　　第四部分：維漢民族結(jié)直腸癌患者臨床病理特點(diǎn)及預(yù)后的對(duì)照研究
　　目的：探討新疆地區(qū)結(jié)直腸癌病例在維吾爾族及漢族之間的分布、臨床病理特征

23、以及預(yù)后情況。
　　方法：收集自2000年1月至2007年12月間就診于新疆醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院，經(jīng)病理證實(shí)的漢族和維吾爾族結(jié)直腸癌患者1421例資料，分析并比較其分布、臨床病理特征及預(yù)后情況。
　　結(jié)果：本組1421例中，漢族1210例（年齡19~92歲，平均年齡62.3±4.5），維族211例（年齡17~87歲，平均年齡52.4±15.6）。維漢民族結(jié)直腸癌患者在性別、年齡、職業(yè)、血型、組織類(lèi)型等因素構(gòu)成比有顯著性差異(

24、P＜0.05)。本組生存時(shí)間為7個(gè)月~122個(gè)月，平均為46.11個(gè)月。漢族患者中位總生存率、無(wú)病生存率和腫瘤相關(guān)生存率分別為45、62和65個(gè)月，而維族患者分別為42、49和61個(gè)月，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.000,P=0.005, P=0.007)。所有患者總生存率為1年87.0%，3年49.1%，5年16.7%。
　　結(jié)論：維吾爾族結(jié)直腸癌患者較漢族患者具有較年輕發(fā)病，腫瘤惡性程度相對(duì)較高，預(yù)后不良的特點(diǎn)。應(yīng)該重視此特點(diǎn)，