IGFBP-rP1與結(jié)直腸癌、Ⅱ型糖尿病關(guān)系的研究.pdf

1、隨著人民生活水平的不斷提高和生活方式的改變，代謝綜合征作為一個(gè)獨(dú)立的疾病引起了廣泛的關(guān)注，其發(fā)病率以較快的速度增長(zhǎng)。代謝綜合征是一組臨床癥候群，其共同的病理生理基礎(chǔ)是胰島素抵抗和高胰島素血癥，因此又稱(chēng)為胰島素抵抗綜合癥。依據(jù)1998年WHO專(zhuān)家委員會(huì)對(duì)代謝綜合征的診斷標(biāo)準(zhǔn)，上海社區(qū)20-74歲人群中代謝綜合征的患病率為17.14％。美國(guó)全國(guó)健康和營(yíng)養(yǎng)調(diào)查資料(1999-2000年)顯示代謝綜合征標(biāo)化和非標(biāo)化發(fā)病率為26.7％和27.0％

2、。因此代謝綜合征已成為嚴(yán)重危害人民健康的常見(jiàn)病和多發(fā)病。 目前對(duì)代謝綜合征分子機(jī)制的了解還處于初級(jí)階段。近年來(lái)對(duì)代謝綜合征研究關(guān)注的重點(diǎn)是伴發(fā)的心血管系統(tǒng)疾病，相對(duì)而言與腫瘤的關(guān)系關(guān)注較少。Ⅱ型糖尿病是代謝綜合征最常見(jiàn)的臨床表現(xiàn)，目前關(guān)于Ⅱ型糖尿病與腫瘤發(fā)生之間的關(guān)系已有大量的流行病學(xué)研究并取得一致性的結(jié)果。肥胖和體重超重可以增加惡性腫瘤的發(fā)病率和死亡率，特別是結(jié)直腸癌、子宮內(nèi)膜癌、乳腺癌和前列腺癌等。Ⅱ型糖尿病病人發(fā)生結(jié)直腸癌

3、的風(fēng)險(xiǎn)升高(結(jié)腸癌的相對(duì)危險(xiǎn)度RR為1.49)。接受胰島素治療的Ⅱ型糖尿病病人較不需要胰島素治療的糖尿病病人，結(jié)直腸癌發(fā)生的危險(xiǎn)度增大，且危險(xiǎn)度與胰島素應(yīng)用的時(shí)間長(zhǎng)短有關(guān)。這些研究提示架接代謝綜合征／Ⅱ型糖尿病和腫瘤的橋梁是高胰島素血癥，但迄今為止，高胰島素血癥在腫瘤發(fā)生過(guò)程中的具體機(jī)制因缺乏深入研究而仍未明確。 IGFBP-rP1是我們實(shí)驗(yàn)室在1999年用抑制性差減雜交法(SSH)構(gòu)建的結(jié)直腸腺癌相對(duì)正常粘膜(T-N)文庫(kù)中篩

4、出、在腺癌中高表達(dá)的一個(gè)基因。目前認(rèn)為IGFBP-rP1與腫瘤關(guān)系密切。除個(gè)別研究報(bào)道IGFBP-rp1在乳腺癌、前列腺癌中表達(dá)上調(diào)外，大部分報(bào)道認(rèn)為IGFBP-rP1在多種人類(lèi)腫瘤，如腦膜瘤、肺癌、肝癌等中均存在表達(dá)下調(diào)的現(xiàn)象。體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)IGFBP-rP1能通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡抑制腫瘤的生長(zhǎng)和進(jìn)展?，F(xiàn)有文獻(xiàn)均支持IGFBP-rP1在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)高于正常組織，提示IGFBP-rP1在結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展中可能起著重要作用。我們?cè)谇捌?/p>

5、工作中還發(fā)現(xiàn)結(jié)直腸癌組織中IGFBP-rP1的表達(dá)與病人的空腹血糖濃度呈正相關(guān)，在4例合并Ⅱ型糖尿病的結(jié)直腸癌病人的腫瘤組織中IGFBP-rP1均呈現(xiàn)高表達(dá)，提示IGFBP-rP1參于Ⅱ型糖尿病和結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展。作為一個(gè)分泌蛋白，Yamanaka等研究發(fā)現(xiàn)IGFBP-rP1可以與胰島素高親和力的結(jié)合，抑制胰島素發(fā)揮正常的生物學(xué)作用，進(jìn)一步說(shuō)明IGFBP-rP1與Ⅱ型糖尿病之間存在密切聯(lián)系。這些研究發(fā)現(xiàn)IGFBP-rP1與腫瘤、Ⅱ型糖

6、尿病的發(fā)生有關(guān)，提示IGFBP-rP1可能是聯(lián)系腫瘤與Ⅱ型糖尿病的關(guān)鍵因子。本課題旨在通過(guò)兩部分研究，探索IGFBP-rP1與結(jié)直腸癌、Ⅱ型糖尿病之間的關(guān)系以及IGFBP-rP1在結(jié)直腸癌發(fā)展過(guò)程中的生物學(xué)作用。 結(jié)直腸癌是嚴(yán)重危害人類(lèi)健康的常見(jiàn)惡性腫瘤之一。近幾年全球結(jié)直腸癌的發(fā)病率急劇上升，在西方發(fā)達(dá)國(guó)家居民惡性腫瘤死因順位中結(jié)直腸癌位居第二。在我國(guó)隨著居民生活方式和飲食結(jié)構(gòu)的改變，結(jié)直腸癌的發(fā)病率基本呈上升趨勢(shì)，在惡性腫瘤

7、中結(jié)直腸癌的發(fā)病率居第三、四位左右。因此對(duì)結(jié)直腸癌發(fā)病機(jī)制以及防治策略的研究具有十分重要的現(xiàn)實(shí)意義。 目前關(guān)于結(jié)直腸癌的診治還沒(méi)有取得突破性進(jìn)展，提高早期結(jié)直腸癌的診斷率是當(dāng)前結(jié)直腸癌防治工作的重點(diǎn)。通過(guò)血清ELISA檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，正常人群血清中IGFBP-rP1與年齡、性別等各參數(shù)之間不存在相關(guān)性，但其與結(jié)直腸癌的發(fā)生呈正相關(guān)，IGFBP-rP1濃度越高，患結(jié)直腸癌的可能性就越大。多步回歸分析也指出IGFBP-rP1與結(jié)直腸癌密切

8、相關(guān)。這些結(jié)果提示有望通過(guò)IGFBP-rP1血清學(xué)檢查對(duì)結(jié)直腸癌進(jìn)行篩查。胰島素抵抗是Ⅱ型糖尿病的發(fā)病基礎(chǔ)。IGFBP-rP1作為胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白家族的一個(gè)成員，可以和胰島素以高親和力結(jié)合，抑制胰島素與其受體結(jié)合，阻礙胰島素發(fā)揮正常生物學(xué)作用，從而引起“胰島素抵抗”現(xiàn)象。我們發(fā)現(xiàn)Ⅱ型糖尿病病人中IGFBP-rP1濃度顯著高于正常人群，其血清濃度是正常對(duì)照的700倍左右。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)IGFBP-rP1與Ⅱ型糖尿病之間密切相關(guān)。與

9、血糖一樣，IGFBP-rP1可以作為Ⅱ型糖尿病檢測(cè)的血清學(xué)指標(biāo)。體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，胰島素可以誘導(dǎo)結(jié)直腸癌細(xì)胞表達(dá)IGFBP-rP1，說(shuō)明IGFBP-rP1可能通過(guò)胰島素/胰島素抵抗而與Ⅱ型糖尿病相關(guān)。 通過(guò)第一部分的研究我們發(fā)現(xiàn)IGFBP-rP1確實(shí)與結(jié)直腸癌、Ⅱ型糖尿病密切相關(guān)，IGFBP-rP1可以作為Ⅱ型糖尿病的血清學(xué)檢測(cè)指標(biāo)。IGFBP-rP1可能通過(guò)胰島素抵抗聯(lián)系結(jié)直腸癌和Ⅱ型糖尿病。但迄今為止，IGFBP-rP1在結(jié)直腸

10、癌和Ⅱ型糖尿病中的確切作用機(jī)制還不明了，在下一部分中我們選取IGFBP-rP1在結(jié)直腸癌中的生物學(xué)作用進(jìn)行重點(diǎn)研究。 我們將IGFBP-rP1 cDNA轉(zhuǎn)染到兩株具有不同遺傳背景、不表達(dá)內(nèi)源性IGFBP-rP1的結(jié)直腸癌細(xì)胞系RKO和CW2中，RT-PCR以及細(xì)胞分泌上清Western blot證實(shí)了。IGFBP-rP1的表達(dá)后，對(duì)IGFBP-rP1在結(jié)直腸癌細(xì)胞中的生物學(xué)效應(yīng)展開(kāi)一系列研究。 細(xì)胞劃痕遷移實(shí)驗(yàn)和tran

11、swell小室侵襲實(shí)驗(yàn)顯示：IGFBP-rP1對(duì)結(jié)直腸癌RKO、CW2細(xì)胞的侵襲遷移能力沒(méi)有影響。細(xì)胞鋪板劃痕后每天對(duì)劃痕寬度進(jìn)行測(cè)量。劃痕寬度改變差異在轉(zhuǎn)染前后兩株結(jié)直腸癌細(xì)胞系中并不明顯。同時(shí)我們也觀察到轉(zhuǎn)染前后結(jié)直腸癌細(xì)胞株的侵襲能力沒(méi)有發(fā)生明顯改變。在transwell小室侵襲實(shí)驗(yàn)中，轉(zhuǎn)染前后兩株細(xì)胞系均未向基底膜下侵襲。但通過(guò)對(duì)轉(zhuǎn)染IGFBP-rP1前后細(xì)胞粘附分子表達(dá)檢測(cè)卻發(fā)現(xiàn)，IGFBP-rP1可以降低E-cadherin

12、和β-catenin的表達(dá)(p<0.05)。E-cadherin和β-catenin的差異表達(dá)與細(xì)胞侵襲遷移能力未發(fā)生改變生物學(xué)行為不相一致，說(shuō)明E-cadherin和β-catenin并非是細(xì)胞遷移活動(dòng)能力增強(qiáng)的原因，而是IGFBP-rP1在結(jié)直腸癌細(xì)胞中發(fā)揮生物學(xué)作用過(guò)程中伴隨的現(xiàn)象。 MTT結(jié)果顯示：IGFBP-rP1可以抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的生長(zhǎng)。轉(zhuǎn)染IGFBP-rP1后的RKO、CW2細(xì)胞的生長(zhǎng)速度明顯要慢于轉(zhuǎn)染空載體對(duì)照組(RK

13、O：P=0.008；CW2：p=0.03)。碘化丙錠(propidium iodide，PI)單染流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染IGFBP-rP1后，細(xì)胞出現(xiàn)G1期阻滯。IGFBP-rP1-RKO VS對(duì)照：G1 76.1％VS61％，p<0.05；IGFBP-rP1-CW2 VS對(duì)照：G1 14.1％VS0.83％，P<0.05。 衰老相關(guān)的β-半乳糖苷酶(senescence-associated β-galaetosidase s

14、taining，SA-β-gal)染色顯示：IGFBP-rP1能夠誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生衰老樣改變。轉(zhuǎn)染IGFBP-rP1后SA-β-gal染色呈陽(yáng)性的結(jié)直腸癌RKO、CW2細(xì)胞明顯增多(RKO：p=0.034：CW2：p=0.029)。Western blot結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染IGFBP-rP1后出現(xiàn)p53和p16/p21蛋白在細(xì)胞內(nèi)積聚，同時(shí)伴隨磷酸化RB蛋白的表達(dá)下降。這些結(jié)果提示IGFBP-rP1可能通過(guò)p53和pRB信號(hào)通路誘導(dǎo)結(jié)直腸癌細(xì)胞

15、衰老。我們發(fā)現(xiàn)IGFBP-rP1在結(jié)直腸癌細(xì)胞中確實(shí)存在誘導(dǎo)細(xì)胞衰老的生物學(xué)效應(yīng)，進(jìn)一步明確了IGFBP-rP1在結(jié)直腸癌中抑癌的生物學(xué)作用。 IGFBP-rP1在結(jié)直腸癌中發(fā)揮抑癌作用，但是在血清中IGFBP-rP1的表達(dá)與結(jié)直腸癌呈正相關(guān)，同時(shí)腫瘤組織中存在IGFBP-rP1的高表達(dá)，我們認(rèn)為是機(jī)體微環(huán)境在對(duì)抗腫瘤的過(guò)程形成抑癌基因IGFBP-rP1高表達(dá)的現(xiàn)象，IGFBP-rP1仍發(fā)揮抑癌的生物學(xué)作用。引起該現(xiàn)象的確切原因